قراءة مظهر مستعمرات E. coli وغيرها على أجار EMB

يقوم طالب بتخطيط عينة مجهولة على أجار الإيوزين أزرق الميثيلين، ثم يحضّنها طوال الليل، ويعود إلى طبق يحوي مستعمرات داكنة ذات بريق أخضر. يدوّن في الدفتر: "E. coli، مؤكدة". هذا التسجيل يدّعي أكثر مما يمكن للطبق دعمه. فالطبق يُظهر نمط نمو وتخمّر تحت ظروف محددة. أما هوية النوع فهي ادعاء منفصل يحتاج إلى أدلة منفصلة.

يتعامل هذا الدليل مع نتائج أجار EMB باعتبارها مهمة تفسير. فهو يشرح الفكرة الأساسية، ويعرض أطلسًا توضيحيًا للطبق مع الضوابط، ويسمّي الحالات التي قد تكون فيها الصورة التعليمية المألوفة مضللة.

الفكرة وراء الطبق

أجار EMB هو وسط انتقائي وتفريقي في الوقت نفسه. تعمل الصبغتان الإيوزين Y وأزرق الميثيلين على تثبيط العديد من الكائنات موجبة الغرام، لذلك يفضّل الوسط نمو الكائنات سالبة الغرام. تعمل الصبغتان نفسيهما كمؤشرين: عندما يخمّر الكائن السكّر المتاح وينتج كمية كافية من الحمض محليًا، تمتص المستعمرة الصبغة بكثافة وتتحول إلى أرجواني داكن أو أزرق أسود. ومع إنتاج حمض قوي، يمكن لسطح المستعمرة أن يُظهر تقزحًا أخضر معدنيًا. يصف بروتوكول ASM لأطباق أجار الإيوزين أزرق الميثيلين هذا الجمع بين الانتقاء والتفريق ويوفر صورًا مرجعية للتعليم.

هناك تفصيل مهم قبل قراءة أي نتيجة: تحقّق من التركيبة المستخدمة. تحتوي تركيبة Holt Harris Teague الأقدم على اللاكتوز بالإضافة إلى السكروز، بينما يحتوي أجار Levine EMB على اللاكتوز فقط. قد يبدو الكائن الذي يخمّر السكروز وليس اللاكتوز، مثل العديد من عزلات Serratia marcescens، مختلفًا على النسختين. تذكر وثائق الشركة المصنّعة لوسائط EMB هذا الاختلاف في التركيبة صراحة. سجّل الشركة المصنّعة والتركيبة في الدفتر بجانب النتيجة.

يكون أجار EMB المحضّر غير الملقّح عادةً بنيًا محمرًا إلى أرجواني محمر، وأحيانًا مع مسحة خضراء أو راسب دقيق. هذا اللون الخلفي ليس نموًا. قارن كل قراءة بطبق غير ملقّح أو بالخط الأساسي الموثق، واقرأ الطبق الأساسي بعد نحو 18 إلى 24 ساعة من الحضانة الهوائية عند 35 إلى 37 C ما لم يحدد بروتوكول التعليم غير ذلك. قد تغيّر الحضانة الممتدة مظهر التخمّر.

كيفية النظر إلى الطبق

استخدم نوعين من الإضاءة. افحص الطبق أولًا تحت الضوء المنعكس أو المائل وقم بإمالته: فاللمعان المعدني متقزح وقد يظهر أو يختفي حسب زاوية الرؤية. ثم افحصه بالضوء النافذ لتقييم لون المستعمرة والمراكز الداكنة. اعمل من مستعمرات معزولة جيدًا، لأن التزاحم والمستعمرات المجاورة يغيران تراكم الحمض المحلي وقد يكبحان اللون أو يبالغان فيه. توضح مجموعة صور ASM ذلك مباشرة: قد تفقد E. coli في مزرعة مختلطة اللمعان المتوقع لأن الكائنات المحيطة تغير البيئة الحمضية.

أدرج الضوابط كلما سمح التمرين بذلك. تتضمن مجموعة تعليمية شائعة E. coli ATCC 25922 لنمط اللون الأزرق الأسود واللمعان المعدني، وكائنًا غير مخمّر مثل Salmonella Typhimurium ATCC 14028 أو Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 لنمط اللون عديم اللون، وكائنًا موجب الغرام مثل Enterococcus faecalis أو Staphylococcus aureus كضابط تثبيط، كما هو مذكور في جداول ضبط الجودة القياسية لوسائط EMB. إذا افتقد الضابط الإيجابي اللمعان، فاشتبه في الحضانة أو التزاحم أو التركيبة قبل الاشتباه في العينة المجهولة.

أطلس توضيحي للأطباق

الأطباق أدناه رسومات توضيحية مولّدة وليست صورًا لزراعات حقيقية. وهي تعرض النمط الذي يجب البحث عنه، وليس الدرجة الدقيقة للون لأي سلالة منفردة. قارنها مع الصور المرجعية لـ ASM ومع الأطباق الحقيقية من المختبر التعليمي.

الطبق 1: Escherichia coli على أجار EMB، مخمّر لاكتوز قوي

تكون E. coli على أجار EMB عادةً أرجوانية داكنة إلى زرقاء سوداء، وغالبًا مع مركز داكن ولمعان أخضر معدني ناتج عن إنتاج الحمض القوي. اللمعان هو النتيجة الشهيرة التي يبحث عنها الطلاب، لكن يجب اعتباره دليلًا داعمًا وليس تعريفًا. تختلف شدة اللمعان حسب السلالة ووقت الحضانة وكثافة المستعمرات وزاوية الرؤية. غياب اللمعان لا يستبعد E. coli، والمستعمرة الداكنة دون لمعان تشير إلى عدة مخمّرات أخرى. اختر مستعمرة معزولة جيدًا لأي عمل متابعة بدلًا من القراءة من منطقة مزدحمة.

الطبق 2: Klebsiella pneumoniae على أجار EMB، مخمّر مخاطي

تكوّن Klebsiella pneumoniae على أجار EMB عادةً مستعمرات كبيرة لامعة ومخاطية بدرجات وردي أرجواني إلى بني أرجواني، غالبًا مع مراكز داكنة ولكن عادةً دون لمعان معدني قوي. يظهر شكل مشابه مع مخمّرات مرتبطة مثل Enterobacter. القوام المخاطي وحجم المستعمرة جزء من القراءة: فالمستعمرة الوردية الصغيرة والمسطحة تحمل دلالة مختلفة عن المستعمرة المخاطية الكبيرة المقببة. كما هو الحال مع E. coli، يقترح الطبق نمط تخمّر، أما تسمية النوع على مستوى الأنواع فتحتاج إلى تأكيد كيميائي حيوي موضح أدناه.

الطبق 3: Salmonella على أجار EMB وغير المخمّرات الأخرى، مستعمرات عديمة اللون

تنمو Salmonella على أجار EMB وغير المخمّرات المرتبطة بها للاكتوز، بما فيها Shigella والعديد من عزلات Pseudomonas، عادةً كمستعمرات عديمة اللون إلى شفافة أو كهرمانية باهتة. قد تعطي بعض التركيبات والظروف مسحة وردية خفيفة، لذلك لا تعني المستعمرة الوردية الباهتة تلقائيًا أنها مخمّرة. لا يميز EMB بين Salmonella وShigella أو غيرهما من غير المخمّرات؛ فهذا التمييز يعود إلى الاختبارات اللاحقة. لاحظ أيضًا أن سلالات Salmonella موجبة اللاكتوز ذات المستعمرات المعدنية الشبيهة بـ E. coli موثقة، وهذا سبب إضافي لعدم قدرة طبق واحد على حسم الحالة.

الطبق 4: Serratia marcescens وفخ التركيبة

تستحق Serratia marcescens قسمًا خاصًا لأن الطلاب غالبًا يتوقعون مستعمرات حمراء ثم يسيئون قراءة الطبق. معظم العزلات السريرية لا تخمّر اللاكتوز، لذلك تظهر عادةً باهتة إلى ضعيفة اللون على Levine EMB. وبما أن العديد من العزلات تخمّر السكروز، فقد تعطي التركيبة المحتوية على السكروز تفاعلًا أغمق أو مرتبطًا بزيادة الحمض. لا تتوقع صبغة prodigiosin الحمراء الكلاسيكية عند 35 إلى 37 C أيضًا؛ فإنتاج الصبغة غير موثوق عند درجة حرارة الحضانة. عندما يذكر البروتوكول Serratia marcescens على أجار EMB، تحقق من التركيبة التي يفترضها النص. يلخص استعراض أيض Serratia النمط خلف هذا الفخ، بما في ذلك سلبية اللاكتوز وتغير تخمير السكروز.

الطبق 5: الضوابط والكائنات المثبطة

تُثبط الكائنات موجبة الغرام مثل Staphylococcus وEnterococcus وStreptococcus وBacillus عمومًا أو يقل نموها بشدة على أجار EMB، رغم أن التثبيط ليس مطلقًا لكل سلالة. تجعل مجموعة الضوابط القراءة أكثر دقة: يجب أن يُظهر ضابط E. coli نموًا جيدًا مع اللون الأزرق الأسود واللمعان، ويجب أن يُظهر ضابط غير المخمّر نموًا عديم اللون، ويجب أن يُظهر ضابط التثبيط نموًا قليلًا أو معدومًا. إذا نما ضابط التثبيط جيدًا، فقد فشلت الخطوة الانتقائية وتصبح كل قراءة أخرى لهذه الدفعة موضع شك. تجيب طرق الصبغ عن سؤال مختلف عن أوساط الزرع؛ ولجانب صبغ الشرائح في المختبر، راجع أطلس صبغ أزرق الميثيلين.

مقارنة محدودة

تلخص ثلاث جمل المظاهر المضللة. اللون الداكن لا يعني E. coli، لأن Klebsiella وEnterobacter ومخمّرات أخرى قد تطور مراكز داكنة دون لمعان. اللون الوردي لا يعني Klebsiella، لأن المخمّرات المتوسطة أو البطيئة وبعض غير المخمّرات الاسمية قد تظهر باللون الوردي أو الخزامي. اللمعان لا يعني E. coli بشكل نهائي، لأن مخمّرات قوية أخرى يمكن أن تنتجه. توضح بروتوكولات التعليم وصور المزارع المختلطة فيها كل هذه الإخفاقات.

حدود التأكيد

يُبلغ أجار EMB عن نمط ظاهري وليس عن نوع. يمكن لكائنات مختلفة مشاركة مظهر مستعمرة واحد، ويمكن لكائن واحد أن ينحرف عن صورته التعليمية بسبب السلالة والعمر والتزاحم والتركيبة والحضانة. لهذا تتعامل إجراءات التعليم والعمل المخبري السريري مع شكل EMB باعتباره مؤشرًا أوليًا.

سير عمل طالب يمكن الدفاع عنه هو: وصف المستعمرة المعزولة (الحجم واللون والمركز واللمعان تحت الضوء المائل والصفة المخاطية)، وتسجيل التركيبة ووقت ودرجة حرارة الحضانة والضوابط؛ ثم إعادة زرع مستعمرة معزولة جيدًا للحصول على نقاوة قبل أي اختبار تأكيدي. تشمل المتابعات الشائعة صبغة غرام بالإضافة إلى تفاعلات IMViC للتعرف المبدئي على E. coli والبكتيريا القولونية، وTSI أو KIA ولوحات الاختبارات الكيميائية الحيوية الخاصة بالكائنات للكائنات المعوية، مع الاختبارات المصلية أو MALDI TOF أو غيرها من وسائل التعرف الموثقة عندما تتطلب المهمة ذلك. للحصول على خلفية حول موقع EMB بين الأوساط الانتقائية والتفريقية للكائنات المعوية، راجع مقدمات أوساط زرع المعويات ومتابعة صبغة غرام. وللسؤال المرتبط بما يمكن أن تثبته صبغة الشريحة الزرقاء وما لا يمكنها إثباته، يحافظ أطلس صبغ أزرق الميثيلين على الفصل بين الملاحظة والاستنتاج بالنهج نفسه.

اكتب الملاحظة قبل الاستنتاج. "مستعمرات زرقاء سوداء داكنة مع لمعان أخضر يعتمد على زاوية الرؤية على Levine EMB بعد 24 ساعة، ومتوافقة مع تخمّر لاكتوز قوي" عبارة يمكن الدفاع عنها. أما "E. coli، مؤكدة" فتحتاج إلى خطوة التأكيد التي لا يستطيع الطبق وحده توفيرها.