اختبارات أزرق الميثيلين للخميرة: عدّ الخلايا الحية مقابل توقيت التنفس

يوجد أنبوبان على الطاولة. كلاهما أزرق. في أحدهما تعني الخلايا الزرقاء تحت المجهر أن الخميرة ميتة. وفي الآخر يعني تحول الأنبوب من الأزرق إلى عديم اللون أن الخميرة حية وتتنفس. الصبغة نفسها، لكن القراءة مختلفة تمامًا. الخلط بين الاختبارين يؤدي إلى عكس كل استنتاج.

هذا الفرق هو محور المقالة. أزرق الميثيلين صبغة أكسدة واختزال: يكون أزرق عند الأكسدة، وعديم اللون عند الاختزال إلى ليوكوأزرق الميثيلين. يستفيد اختبار الحيوية من هذه الكيمياء في لقطة مجهرية قصيرة، بينما يستفيد اختبار التنفس منها في تفاعل حجمي مقاس بالزمن. يحتاج كل اختبار إلى بروتوكوله وضوابطه ودرجة الشك الخاصة به.

اختبار الحيوية: صبغ قصير وقراءة فورية

يُعد بروتوكول أسلوب مصانع الجعة النسخة الأكثر توحيدًا. حضّر 0.01% w/v من أزرق الميثيلين في 2% سترات الصوديوم، وامزجه بنسبة 1:1 مع معلق الخميرة، وافحص الخليط بعد فترة زمنية قصيرة وثابتة. تختلف الفترات المنشورة من 1 إلى 2 دقيقة في دليل Brewing Science Institute إلى نحو 5 دقائق في البروتوكولات البحثية، بينما تتطلب طريقة OIV لعلم أحياء الخمر الفحص خلال 10 دقائق. ينتهي تركيز الصبغة في خليط العد قريبًا من 0.005%.

حمّل غرفة Neubauer المحسّنة، وباستخدام تكبير يقارب 400x صنّف الخلايا الزرقاء الداكنة كغير حية والخلايا غير المصبوغة كحية. تُحسب الخلايا الزرقاء الفاتحة حية في طريقة OIV، مما يوضح مشكلة التقدير الذاتي.

يُحسب تركيز الخلايا من هندسة الغرفة. عند عدّ المربع المركزي الكامل ذي 1 mm، يكون عدد الخلايا لكل mL مساويًا لـ N مضروبًا في عامل التخفيف ثم 10^4، حيث N هو العدد في المساحة المحددة، كما هو موضح في طرق ASBC للخميرة. الحيوية أبسط: الخلايا غير المصبوغة مقسومة على مجموع الخلايا مضروبًا في 100. عُدّ نحو 400 خلية لتقدير الحيوية، وفقًا لـ دراسة مقارنة FEMS للمصانع وممارسة OIV.

يجب تحديد قاعدة ثابتة للحدود، مثل تضمين الخلايا على الخطين السفلي والأيسر واستبعاد الخلايا على الخطين العلوي والأيمن.

تحتاج البراعم إلى قاعدة قبل بدء العد. الاتفاق الشائع يعد البرعم خلية منفصلة عندما يصل إلى نحو نصف حجم الخلية الأم. أي قاعدة تختارها يجب تطبيقها على كل مربع وتسجيلها في ورقة العمل.

ورقة العد (للطباعة)

هذه الورقة أصلية لهذه المقالة. انسخها إلى دفتر أو اطبع نسخة لكل عينة.

الحيوية (%) = 100 x غير المصبوغ / (غير المصبوغ + الأزرق الداكن).
إجمالي الخلايا لكل mL = N x عامل التخفيف x 10^4، حيث يأتي N من مساحة الغرفة المحددة. سجّل فترة الصبغ بجانب النتيجة، لأن رقم الحيوية دون توقيته غير قابل لإعادة الإنتاج.

لماذا تتغير أرقام الحيوية

التوقيت هو أول عامل تداخل. الخلايا النشطة أيضيًا تختزل الصبغة، لذلك قد تلتقط القراءة المبكرة خلايا حية قبل إكمال الاختزال وتخطئ في تصنيفها كميتة. لكن التعرض الطويل سام بحد ذاته وقد ينتج خلايا زرقاء متضررة فعليًا. لذلك يحدد بروتوكول تعليمي مخبري التسجيل خلال 5 دقائق، كما هو موثق في بروتوكول تعليم خميرة Wisconsin.

الصياغة الآمنة هي أن قياس أزرق الميثيلين يعتمد على الزمن، لذلك ثبّت فترة قصيرة واحدة لجميع العينات.

العينات ذات الحيوية المنخفضة تحمل انحيازًا إضافيًا. تحذر الطريقة المعيارية من أن أزرق الميثيلين قد يبالغ في تقدير الحيوية الحقيقية تحت نحو 80%، لأن الخلايا التي تختزل الصبغة لا يلزم أن تحتفظ بالقدرة التكاثرية. تعامل مع أزرق الميثيلين كتقدير سريع تقريبي، وأكد القرارات المهمة باستخدام عدّ الأطباق أو صبغة مكملة.

تأتي تأثيرات الوسط بعد ذلك. تعمل طريقة OIV قرب pH 4.6 وتحذر من أن العينات منخفضة pH والمُنظّمة بقوة قد تمنع سلوك الصبغة الصحيح، كما تنصح بعدم استخدام الاختبار فوق 100 g/L من السكر. كما أظهرت مقارنة تجريبية لاعتماد حساسية الصبغ على pH تغيرات كبيرة ضمن النطاق المختبر، بما يتوافق مع دراسة طريقة أزرق الميثيلين المعتمدة على pH.

تجربة التنفس: توقيت اختفاء الأزرق

الاختبار الثاني لا ينظر عبر المجهر. توضع الخميرة مع الجلوكوز وأزرق الميثيلين المخفف في أنبوب مغلق، ويقيس الزمن اللازم لاختفاء اللون الأزرق. أثناء الاستقلاب تولد الخلايا مكافئات اختزال تحول الصبغة إلى شكل عديم اللون، بينما يعيد الأكسجين المذاب أكسدتها.

تعكس النهاية توازن التنفس وتركيز الصبغة وتوفر الأكسجين، ويجب الإبلاغ عنها كزمن اختزال أو إزالة لون أزرق الميثيلين، وليس كمعدل مباشر لاستهلاك الأكسجين الجزيئي.

استخدم صبغة أكثر تخفيفًا بكثير من اختبار الحيوية. يوضح دليل AQA A level العملي إعدادًا موحدًا: 1 g جلوكوز لكل 100 mL ماء دافئ قرب 30 C، و5 g خميرة جافة، وصبغة عمل قرب 0.001%.

امزج 2 mL من معلق الخميرة والجلوكوز مع 2 mL من الصبغة، ووازن درجة الحرارة، ورج مرة واحدة لمدة 10 ثوانٍ، وابدأ المؤقت، ولا ترج مرة أخرى. إعادة الرج تعيد إدخال الأكسجين وتعيد اللون الأزرق، وهو أكبر خطأ إجرائي.

عرض زمني (أصل المقالة)

الجدول التالي عرض أصلي باستخدام إعداد AQA: 2 mL خليط خميرة وجلوكوز مع 2 mL صبغة عمل قرب 0.001%، ورج واحد لمدة 10 ثوانٍ ثم حضانة دون إزعاج.

ارسم مؤشر المعدل مقابل درجة الحرارة للأنابيب A وB وC. لا تمثل الأنابيب D وE وF نقاطًا على المنحنى، بل هي الضوابط التي تجعل تفسيره ممكنًا.

الضوابط التي تجعل كل اختبار ذا معنى

يحتاج كل تشغيل للتنفس إلى ثلاثة مكونات إضافية. يجب أن تبقى الخميرة المغلية أو المقتولة مع الجلوكوز والصبغة زرقاء، لإثبات أن الاختزال السريع يعتمد على الأيض الحي. الخميرة الحية مع الصبغة دون جلوكوز هي ضابط الركيزة، وقد يظهر اختفاء بطيء للون بسبب الاحتياطي الداخلي. الجلوكوز مع الصبغة دون خميرة هو الضابط الكيميائي.

يحتاج عدّ الحيوية إلى ثبات إجرائي مختلف: نفس مخزون الصبغة، نفس نسبة الخلط، نفس فترة الصبغ، نفس مساحة الغرفة، ونفس قواعد البراعم والحدود. ترتبط تقنيات تحضير ورؤية الخلايا المصبوغة بـ طرق الصبغ البكتيري البسيطة، بينما يوجد المسح الأوسع لما تميّزه الصبغة في أطلس صبغات المجهر.

اختر الاختبار حسب السؤال. كم عدد الخلايا الحية الآن هو سؤال عدّ يُجاب عنه بالمجهر وورقة العمل. مدى نشاط تنفس هذه المزرعة هو سؤال حركي يُجاب عنه بالمؤقت والأنابيب المضبوطة. يخدم أزرق الميثيلين كلا الاستخدامين، لكن ليس في الأنبوب نفسه وفي الوقت نفسه.