أزرق الميثيلين والإشارات الالتهابية: الجسيمات الالتهابية، IL-6، وSTAT3

لنفترض أن ثلاثة مختبرات أفادت بأن المركب الأزرق نفسه مضاد للالتهاب. أظهر أحدها انخفاض IL-1beta من الخلايا البلعمية. وأظهر آخر انخفاض إنزيم iNOS في نوع الخلايا نفسه. وأظهر ثالث انخفاض IL-6 في الدم وانخفاض نشاط STAT3 في الدماغ. من المغري دمج النتائج الثلاث في ادعاء واحد. لكن هذا الدمج يحجب النتيجة الفعلية.

تنتمي كل نتيجة إلى مفهوم إشاري مختلف له محفزه وخطوة تجميعه وقراءة القياس الخاصة به. ويتفاعل أزرق الميثيلين مع كل مفهوم عند نقطة مختلفة. أما ما إذا كان أي من ذلك يحسن نتيجة صحية فهو سؤال منفصل نتناوله في نظرتنا العامة على أزرق الميثيلين والالتهاب. تقتصر هذه الصفحة على المسارات.

المسار 1: تجميع الجسيم الالتهابي وcaspase-1

الجسيم الالتهابي هو هيكل بروتيني يُبنى عند الحاجة داخل خلية نخاعية. وتتكون أجزاؤه من مستشعر، وبروتين موائم يسمى ASC، وإنزيم مؤثر يسمى caspase-1. بعد التجميع، يشطر caspase-1 كلاً من pro-IL-1beta وpro-IL-18 إلى أشكالهما المفرزة، ويمكنه تحفيز pyroptosis، وهو شكل التهابي من موت الخلايا. ويحدد المستشعر النوع: يستجيب NLRP3 للبلورات والسموم المكوِّنة للمسام مثل nigericin وATP، ويستجيب NLRC4 للسوط البكتيري، ويستجيب AIM2 للـ DNA مزدوج السلسلة الموجود في السيتوسول، بينما يستجيب المسار غير التقليدي للـ lipopolysaccharide داخل الخلايا.

يتطلب التنشيط إشارتين. الإشارة الأولى هي التهيئة: تدفع ربيطة لمستقبل شبيه بتول عملية نسخ تعتمد على NF-kB لكل من NLRP3 وpro-IL-1beta بحيث تصبح المكونات موجودة. أما الإشارة الثانية فهي التجميع: يتسبب محفز ثانٍ في تكوين ASC لتجمعات قليلة الوحدات على هيئة بقع، وشطر caspase-1 إلى الجزء p20، وإطلاق IL-1beta p17 الناضج. وتُعد أنواع الأكسجين التفاعلية في الميتوكوندريا وابتلاع البلورات من العوامل المعروفة التي تسهم في الإشارة الثانية الخاصة بـ NLRP3.

اختبرت دراسة عام 2017 حول التثبيط الواسع للجسيمات الالتهابية في الخلايا البلعمية أزرق الميثيلين عند كلتا الإشارتين. في الخلايا البلعمية لنخاع عظم الفئران التي جرى تهيئتها بـ lipopolysaccharide، حفز كل من nigericin وATP وبلورات urate أحادي الصوديوم إطلاق IL-1beta وcaspase-1 إضافة إلى تكوين بقع ASC، وخفّض أزرق الميثيلين بتركيز 20 إلى 200 micromolar المؤشرات الثلاثة بطريقة تعتمد على الجرعة من دون قتل الخلايا. وأظهر كل من flagellin وSalmonella بالنسبة إلى NLRC4، والـ DNA مزدوج السلسلة وListeria بالنسبة إلى AIM2، والـ lipopolysaccharide المنقول إلى الخلايا أو E. coli الحية بالنسبة إلى المسار غير التقليدي النمط نفسه. لم يحفز المركب بمفرده الإطلاق، ولم تُظهر أطباق الضبط أي تأثير مضاد للبكتيريا، ولذلك ترتبط النتيجة باستجابة المضيف.

في المراحل السابقة للمسار، قيس أثر ثلاثة تدخلات. انخفض superoxide الميتوكوندري الذي حفزه rotenone مع أزرق الميثيلين، كما انخفض إطلاق IL-1beta الناتج عن rotenone معه. وانخفض امتصاص الخرز الفلوري، بما يتوافق مع انخفاض البلعمة قبل استشعار البلورات. وأظهر مراسل تحكم فيه محفز NLRP3 يحوي موقعين لـ NF-kB نشاطًا أقل مع أزرق الميثيلين، بينما لم يستجب محفز مبتور يفتقر إلى هذين الموقعين. وفي أنبوب خالٍ من الخلايا، خفّض أزرق الميثيلين أيضًا بصورة مباشرة نشاط caspase-1 البشري المؤتلف. كما أن إضافة المركب فقط أثناء التهيئة أو فقط أثناء التنشيط ظلت تقلل إطلاق IL-1beta وIL-18 وcaspase-1، ما يشير إلى مشاركة كلتا الخطوتين.

توافقت اختبارات الفئران مع هذه الانتقائية. قتلت جرعة قاتلة من lipopolysaccharide فئران الضبط خلال ساعات، بينما حسّن أزرق الميثيلين البقاء؛ وانخفض IL-1beta الصفاقي، لكن IL-6 في السائل نفسه لم ينخفض. وفي نموذج التهاب الصفاق بـ Listeria، انخفض IL-1beta الصفاقي بينما ظل العدد الإجمالي للخلايا دون تغيير. وتصرفت وحيدات THP-1 البشرية مثل الخلايا البلعمية للفئران عبر الأنواع الأربعة للجسيمات الالتهابية. تفسر نتيجة تخص الجسيم الالتهابي نضج IL-1beta وIL-18، وليس كل cytokine، ولهذا أيضًا تجيب هيئة الخلايا المناعية في الدماغ ضمن تجارب الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية عن سؤال مختلف عن تجميع الهيكل البروتيني.

المسار 2: نسخ iNOS عبر ارتباط NF-kB وSTAT1

يكاد nitric oxide synthase القابل للتحفيز، أو iNOS، يكون غائبًا في حالة الراحة ويُنسخ عند الحاجة. يدفع lipopolysaccharide هذه العملية أساسًا عبر تحلل IkB-alpha، يتبعه فسفرة NF-kB ودخوله إلى النواة. أما interferon-gamma فيدفعها أساسًا عبر فسفرة STAT1 بواسطة Janus kinase، يتبعها دخول STAT1 إلى النواة. ثم يرتبط كل عامل بموقعه على محفز iNOS. ويشكل نشاط الإنزيم وتحفيز الجين نقطتي تحكم منفصلتين، ويمكن للدواء أن يعمل عند إحداهما أو كلتيهما.

حددت دراسة عام 2015 لتحفيز iNOS في الخلايا البلعمية والفئران المصابة بتسمم الدم الداخلي موضع التأثير عند مستوى الرسالة الجينية. في خلايا RAW 264.7 والخلايا البلعمية الأولية للفئران، أدى إعطاء 1 micromolar من أزرق الميثيلين قبل 30 minutes من lipopolysaccharide أو interferon-gamma أو كليهما إلى خفض بروتين iNOS وmRNA عبر 8 إلى 24 hours، مع انخفاض nitrite في الوسط وعدم فقدان حيوية الخلايا. وفي الفئران التي تلقت 25 mg per kg من lipopolysaccharide، خفّضت جرعة واحدة مقدارها 5 mg per kg أُعطيت قبل ساعة واحدة بروتين iNOS وmRNA في الرئة والكبد والقلب.

التفصيل المميز هو ما لم يتغير. ظل تحلل IkB-alpha وفسفرة NF-kB وفسفرة STAT1 والتراكم النووي لكل من العاملين دون تغيير. حدث الانقطاع بعد ذلك بخطوة واحدة: أظهرت المستخلصات النووية ارتباطًا أقل لـ NF-kB بعنصر الـ DNA الخاص به بعد lipopolysaccharide، وارتباطًا أقل لـ STAT1 بعد interferon-gamma، كما أكد الترسيب المناعي للكروماتين انخفاض إشغال كل من العاملين لمحفز iNOS داخل الخلايا. وانخفض أيضًا tumor necrosis factor alpha، الذي يستخدم محفزه NF-kB كذلك. جرى تنشيط العاملين ووصولهما إلى النواة، لكن ارتباطهما بالـ DNA المستهدف كان أضعف.

لاحظ الاختلاف عن المسار 1. يتعلق هذا بتفاعل العامل مع الـ DNA، ويستخدم STAT1 بدلًا من STAT3، ويقيس mRNA والبروتين وnitrite بدلًا من بقع ASC وأجزاء caspase-1. وتُبقي خريطتنا لأهداف أزرق الميثيلين عبر نماذج الخلايا هذا المستوى النسخي منفصلًا عن قياسات الإنزيمات المباشرة والميتوكوندريا.

المسار 3: IL-6 في المصل وتنشيط STAT3 في الأنسجة

ينقل IL-6 الإشارة عبر عائلة مستقبلات gp130 إلى سلسلة Janus kinase ثم STAT3. يتضاعف STAT3 المفسفر، ويدخل النواة، ويحفز برامج التهابية، في حين أن IL-6 نفسه هدف لـ NF-kB، ولذلك يشكل الاثنان حلقة تغذية راجعة يشار إليها غالبًا بمحور IL-6 إلى STAT3. وتشمل قراءات القياس المعتادة IL-6 في المصل عند بداية المسار، ونسبة STAT3 المفسفر إلى STAT3 الكلي، والإنزيمات المؤثرة مثل iNOS وCOX2 في نهاية المسار.

قاست دراسة عام 2023 على الفئران حول IL-6 وSTAT3 بعد lipopolysaccharide هذا المحور عبر عدة مقصورات. تلقت ذكور فئران C57BL/6 مقدار 1 mg per kg من lipopolysaccharide يوميًا لمدة ثلاثة أيام، مع إعطاء 5 أو 10 mg per kg من أزرق الميثيلين بعد 30 minutes من كل جرعة. في اليوم الثالث، كان IL-6 في المصل أقل في مجموعتي أزرق الميثيلين مقارنة بـ lipopolysaccharide وحده، بينما لم تتغير معظم cytokines الأخرى في اللوحة مع العلاج. وكانت نسب STAT3 المفسفر إلى STAT3 الكلي أقل في القشرة والحصين وجلد الأذن، مع انخفاض صبغة Iba-1 للخلايا الدبقية الصغيرة، وانخفاض iNOS وCOX2، وتخفيف جزئي لفقدان الوزن.

يلزم هنا احتراسان. يتوافق انخفاض IL-6 في المصل مع انخفاض فسفرة STAT3 في الأنسجة مع تعديل المحور، لكنه لا يعزل العقدة الأساسية، لأن انخفاض cytokine في بداية المسار، أو انخفاض إشارات المستقبلات، أو تغير نشاط phosphatase، يمكن أن يؤدي كل منها إلى النسبة نفسها. كما أن تغير الوزن خلال ثلاثة أيام من التحدي الحاد هو قراءة على مستوى الحيوان كله، وليس درجة للأعراض أو الهدأة. فهو يضيف سياقًا يتجاوز نتيجة اللطخة من دون تحويل نتيجة إشارات خلوية إلى ادعاء علاجي. وتسير الكيمياء المنفصلة لمعالجة الأكسدة والاختزال في الميتوكوندريا بالتوازي مع هذا التفسير المتعلق بـ cytokines، ولا ينبغي دمجها معه.

مقارنة المسارات: نقاط التدخل وقراءات القياس

يمنع الجدول ثلاثة انتقالات استدلالية غير صالحة. لا تثبت نتيجة تخص بقع ASC نتيجة تخص STAT3. ولا تثبت نتيجة تخص ارتباط STAT1 بمحفز iNOS نتيجة تخص STAT3، رغم أن كلا البروتينين ينتمي إلى عائلة STAT. كما أن نتيجة IL-6 في المصل لا تثبت انخفاض تجميع الجسيم الالتهابي: ففي تجربة الصفاق انخفض IL-1beta بينما لم ينخفض IL-6. يحتاج كل صف إلى محفزه وقراءة القياس الخاصة به، ولهذا يتطلب تفسير دراسات أزرق الميثيلين الخلوية والحيوانية والسريرية مطابقة كل ادعاء مع المستوى الذي قيس عنده.

لا يثبت أي من ذلك جرعة أو سلامة أو فائدة لدى البشر. نماذج lipopolysaccharide هي محفزات مضبوطة لاختبار آلية، وليست نسخًا مطابقة للمرض المزمن، كما أن إعطاء الجرعات بالتزامن مع المحفز يختبر الوقاية من تغير مستحث بدلًا من عكس مرض قائم بالفعل. أبقِ هذا الوصف الآلي منفصلًا عن نتائج المرضى، وقيّم أي ادعاء صحي استنادًا إلى الدراسة التي أُجريت على المرضى وراءه.