من طوّر صبغة الدم البنفسجية؟ أزرق الميثيلين، ومالاخوفسكي، ورومانوفسكي، وغيمزا

الإيوزين أحمر. وأزرق الميثيلين أزرق. امزجهما، ثم ضع المزيج على لطاخة دم جافة، فتظهر أجزاء منها باللون البنفسجي.

ليست جميع الأجزاء. في المستحضر الجيد، تتلون نوى خلايا الدم البيضاء بالأحمر البنفسجي، ويتخذ الكروماتين داخل طفيلي الملاريا اللون نفسه، بينما تبقى خلايا الدم الحمراء المحيطة وردية ويبقى السيتوبلازم رماديًا مزرقًا. هذا اللون البنفسجي هو ما يتيح تمييز أنواع الخلايا بعضها من بعض.

لا تحتوي أي من الزجاجتين على لون بنفسجي. لا يظهر هذا اللون إلا عندما يلتقي ناتج تحلل معين لأزرق الميثيلين بالإيوزين على الشريحة. وفي ثمانينيات وتسعينيات القرن التاسع عشر، لم يكن أحد يعلم بوجود هذا الناتج، فضلًا عن معرفة ماهيته. كان من يسعون إلى الحصول على اللون يعملون منفردين بأصباغ غير نقية، من دون وسيلة موثوقة لمعرفة ما تحتويه الزجاجة بعد بقائها على الرف شهرين.

لهذا توجد أكثر من إجابة يمكن الدفاع عنها للسؤال الوارد في العنوان، ولهذا تغيرت الإجابة في 2011.

ما تكشفه الصبغة تغير بتغير المزيج

لم تُخترع الصبغة دفعة واحدة، بل تطورت تدريجيًا. أتاح كل تغيير في المزيج معلومة مرئية جديدة واحدة تحديدًا، وتسلسل هذه المعلومات هو أوضح سبيل لقراءة تاريخها.

النمط في العمود الأخير هو المهم. وسّع كل تقدم نطاق الألوان، وجعل كل توسع بنية إضافية مرئية. اللون البنفسجي ليس مجرد إضافة جمالية إلى التقنية؛ فهو الفارق بين رؤية وجود طفيلي ورؤية مكوناته. أما انتقال الصبغة نفسها من مصنع أصباغ تابع لـ BASF إلى الطب، فله تاريخ أطول ووثائقه الخاصة. ويُحفظ التسلسل الكامل أعلاه، مع مصدر كل بند، في خط زمني للمساهمين مرتبط بالمصادر.

الشكل: المزائج الستة نفسها، مرسومة لعرض ما كان في الوعاء وما نتج عنه. تمثل الدوائر الأصباغ؛ وتمثل المربعات أسفلها الألوان التي استطاعت تلك الأصباغ إنتاجها في لطاخة دم. لا يظهر مربع أحمر بنفسجي قبل 1890، ولا يغيب عن أي مزيج بعد ذلك.

الرجل الذي استخدم البوراكس عمدًا

كان إرنست مالاخوفسكي طبيبًا في بريسلاو، التي تُسمى اليوم فروتسواف. أمضى مسيرته المهنية في ممارسة الطب الخاصة وفي عيادة صغيرة أدارها مع زميل، وكان يجري العمل المخبري في وقت فراغه. وُلد في ستشيلنو في 12 مارس 1857، ودرس الطب في جامعة بريسلاو، وعمل من 1882 إلى 1887 مساعدًا في الطب الباطني بمستشفى جميع القديسين، الذي كان آنذاك ثاني أكبر مستشفى في ألمانيا.

بدأ في 1888 بصبغة خينتشينسكي وبلين المزدوجة. وفي مستحضر أعده في 1889، رأى كروماتين نواة المتصورة يتلون بصورة تختلف عن السيتوبلازم، ثم وجد أنه لا يستطيع تكرار النتيجة. جرّب تحميض أزرق الميثيلين، فساءت النتائج. وجرّب جعله قلويًا بالبوراكس، فنجح في كل مرة. عرض الطريقة علنًا في 15 يونيو 1890، ونشر وصفًا أكثر تفصيلًا في أغسطس 1891، تضمن تعليمات استخدام البوراكس. وذكر أن الصبغ استغرق أربعًا وعشرين ساعة وأن النتائج كانت سهلة التكرار.

أربع وعشرون ساعة مدة طويلة في مختبر تشخيصي، ولم تتوسع ورقته في وصف اللون البنفسجي الأحمر لنواة الطفيلي. وأيًا كان السبب، لم يتبنَّ أحد جعل أزرق الميثيلين قلويًا عمدًا حتى أعاد نوخت ذلك في 1898. ولم يكتب مالاخوفسكي عن صبغ الدم مرة أخرى.

سبب قلة المعلومات المعروفة عنه حتى وقت قريب يتعلق بالأرشيف، وليس لغزًا. لم يبقَ في الأدبيات الطبية تقريبًا أي أثر لحياته، وما بقي وصل عبر مسار واحد. غادرت ابنته ماري ألمانيا إلى لندن في 1939، وخدمت في الجيش البريطاني، ثم استقرت في كندا. وانتهى المطاف بمجموعة أوراق الأسرة التي احتفظت بها في معهد ليو بايك في نيويورك. قُتل شقيقها ليو في الحرب العالمية الأولى. ورُحّلت شقيقتها إيفا من بريسلاو إلى معسكر إيزبيتسا العابر في أبريل 1942، ولم تعد قط. وأنهت والدتها هيدفيغ حياتها في 22 أبريل 1942 بدلًا من انتظار الترحيل نفسه. وكان مالاخوفسكي قد توفي في 1934، قبل كل ذلك.

تاريخ الأسرة الذي ينتهي على هذا النحو هو تاريخ يتوقف الاستشهاد به. وقد أُعدت الورقتان اللتان أعادتا إدراج مالاخوفسكي في تاريخ تطور الصبغة، ونُشرتا كلتاهما في 2011، بالاستناد إلى وثائق أرشيفية في بوزنان وفروتسواف وإلى أوراق ماري في نيويورك.

زجاجة متعفنة وروسي حالفه الحظ

درس دميتري رومانوفسكي الطب في الأكاديمية الطبية العسكرية في سانت بطرسبرغ، وعمل على الملاريا طوال معظم مسيرته المهنية. نشر في 1890 طريقة تكاد تطابق، على الورق، طريقة خينتشينسكي: أزرق الميثيلين غير المعدل مع الإيوزين، مع زيادة طفيفة في الإيوزين.

في سبتمبر 1891، نشر الطريقة التي أكسبته شهرته، وكانت التفصيلة الحاسمة مدفونة في التعليمات. جاءت أفضل نتائجه من محلول أزرق الميثيلين المخزون، وهو محلول مخزون من أزرق الميثيلين بقي أكثر من شهرين ونما عليه العفن. أدى العفن وطول مدة التخزين إلى نزع بعض مجموعات الميثيل من الصبغة. لم يكن رومانوفسكي يعلم ذلك ولم يستطع التحكم فيه، ولم يتمكن الباحثون الآخرون الذين جربوا طريقته من الحصول على اللون البنفسجي. وكان قد قدم أطروحته في سانت بطرسبرغ في يونيو 1891، ولهذا تعتبر الرواية المعتادة 1891 سنة الاكتشاف.

أما عرض مالاخوفسكي فكان في يونيو 1890، قبل ذلك بأكثر من عام، وكانت طريقته تحقق النتيجة عمدًا.

لماذا سُمّيت الصبغة باسم الرجل الخطأ

جمعت كريستين كرافتس وإرنست همبلمان وباربرا أوليكسين الأدلة التي تدعم أسبقية مالاخوفسكي، وهي تستند إلى أربعة أمور. تاريخ العرض العلني، يونيو 1890 مقابل سبتمبر 1891. وكلمة عمدًا مقابل كلمة مصادفةً. وحقيقة أن مالاخوفسكي نشر طريقته، بما فيها استخدام البوراكس، بينما اعتمدت طريقة رومانوفسكي على متغير غير مضبوط. والملاحظة بأن وصف نواة المتصورة، مع اللون البنفسجي الذي كشفها، اختفى فعليًا من الأدبيات طوال سبع سنوات، لأن أحدًا لم يستطع تكرار النسخة التي نتجت بالمصادفة.

وقد صاغوا استنتاجهم بصراحة. ففي ورقة السيرة، وصفوا نسبة الفضل هذه بأنها «تشويه للحقيقة»، واستشهدوا برالف ليلي، الذي كتب في 1978: «لعلنا ينبغي أن نشير إلى هذه العائلة من الصبغات باسم صبغات مالاخوفسكي».

هذا الادعاء محل خلاف، كما هي الحال عادةً في ادعاءات الأسبقية، ومن المفيد شرح طبيعة الخلاف بدلًا من حسمه. يجب أن يحدد أي نقاش حول الأسبقية ماهية الاكتشاف. إذا كان الاكتشاف هو اللون البنفسجي، فمالاخوفسكي صاحب العرض الموثق الأسبق. وإذا كان الاكتشاف هو الطريقة المنشورة، فقد نشر الرجلان في 1891، وحملت الصبغة اسم رومانوفسكي. وإذا كان الاكتشاف هو التفسير، فلا يحق لأي منهما ادعاء الأسبقية، لأن أيًا منهما لم يعلم أن التعتيق يعني نزع مجموعات الميثيل، ولم يستطع أي منهما تفسير سبب ظهور اللون أصلًا. وهذه النقطة الأخيرة هي ما تتجاوزه الروايات الشائعة. كان المكون الفعّال شائبة لم يحددها أحد، وأول من أنتج اللون عمدًا فعل ذلك باستخدام وصفة تجريبية قابلة للتكرار، لا انطلاقًا من فهم ما تفعله الوصفة.

الورقتان المنشورتان في 2011 هما العرض المنشور الأكثر اكتمالًا للأدلة التي تدعم أسبقية مالاخوفسكي، وكلتاهما متاحة للقراءة مجانًا على PubMed: المراجعة المطولة في PMID 21235291 وورقة السيرة في PMID 21660627. ويُدرج سجل المراجعة في PubMed أيضًا تعليقًا عليها، نُشر في المجلة نفسها لاحقًا في ذلك العام في 86(5):366، وهو تذكير وجيه بأن هذا الطرح واجه اعتراضًا منشورًا فور ظهوره.

لا يتعلق هذا النزاع بخلاف حول الكيمياء. فجميع المعنيين متفقون على ماهية اللون البنفسجي والمكونات التي تنتجه. وإنما يتعلق الخلاف بمن توصل إليه أولًا، وبما إذا كانت مصادفة لم يستطع أحد تكرارها تُعد وصولًا إليه أصلًا.

ما أضافه أصحاب الأسماء اللاحقة

إذا كان مالاخوفسكي أول من أنتج اللون البنفسجي، فلماذا تحمل الصبغة أسماء رومانوفسكي ورايت وغيمزا؟

لأن الصبغة التي تعمل مرة واحدة بين يدي مخترعها لا تكفي لتكون كاشفًا مخبريًا. حوّل العمل اللاحق مزيجًا متقلب السلوك إلى مادة يستطيع فني في بلد آخر استخدامها في يوم ثلاثاء عادي.

توصل نوخت إلى النتيجة بالاستدلال. فبعد إخفاقه في الحصول على نتيجة موثوقة من صبغة متعادلة بسيطة، استنتج أن اللون البنفسجي لا بد أن يأتي من مادة موجودة في أزرق الميثيلين وليست أزرق الميثيلين نفسه، وبدأ البحث عنها. وكان أونا قد لاحظ بالفعل أن محاليل أزرق الميثيلين القديمة تصبغ حبيبات الخلايا البدينة بالأحمر، واقترح أن مادة جديدة تتكون مع تعتيق الصبغة. وكان برنثسن قد أثبت في 1885 أن الظروف القلوية تنزع مجموعات الميثيل من أزرق الميثيلين، وأن هذه النواتج هي ما نسميه اليوم أصباغ الآزور. استخلص نوخت الجزء الفعّال بالكلوروفورم، ولم يستطع تسميته إلا الأحمر الناتج من أزرق الميثيلين؛ وأطلق عليه ميكايليس اسم آزور I في 1901. وحل جينر مشكلة الإعداد والاستخدام. فقد أتاحت إعادة إذابة راسب أزرق الميثيلين والإيوزين في الميثانول المطلق محلولًا واحدًا مستقرًا يثبّت اللطاخة أثناء صبغها، وألغت الحاجة إلى التثبيت بالحرارة. وجمع ليشمان ورويتر بين صبغة متعددة الألوان ومذيب كحولي، فحصلا على الاستقرار واللون البنفسجي معًا. واستبدل رايت الحضانة لمدة اثنتي عشرة ساعة عند 65 °C والترك لمدة عشرة أيام بساعة واحدة في تيار من البخار. وتوقف غيمزا تمامًا عن الاعتماد على محلول تعتّق عشوائيًا، مستخدمًا كميات مقيسة من أصباغ معروفة مع الغليسرول في الميثانول، ليظل المنتج صالحًا في حرارة المناطق المدارية. ولم ينشر قط طريقة تحضيره لآزور الميثيلين النقي. بل باعه إلى مختبر الدكتور غروبلر في لايبزيغ، الذي سوّقه باسم آزور I وادعى أن نسخته وحدها هي صبغة غيمزا الأصلية.

لا تزال هوية ذلك الآزور محل نقاش. يرى البعض أنه لم يكن سوى أزرق الميثيلين متعدد الألوان، ويرى آخرون أنه كان غنيًا بـ Azure B. وجاءت الإجابة في سياق حرب. عندما تعذر الحصول على الأصباغ الألمانية، وجد فريق من خدمة الصحة العامة في الولايات المتحدة، ضم رالف ليلي مع موريس رو وإيمي ويلكوكس، أن أفضل صبغ ينتج من ثلاثة مكونات منفصلة: أزرق الميثيلين غير المعدل، وناتج تحلله المنزوع مجموعات الميثيل Azure B، والإيوزين. حل Azure B محل آزور I الذي لم يعد متاحًا، ولا تزال هذه المكونات الثلاثة أساس الصبغة المستخدمة لتشخيص الملاريا اليوم.

كيمياء تفاعل هذه المكونات الثلاثة على الشريحة مسألة منفصلة تتناولها صفحة أخرى. تتناول صفحة أدوار الأصباغ وكيمياء صبغات رومانوفسكي ما يفعله كل من Azure B والإيوزين، ولماذا ينتج اجتماعهما لونًا لا ينتجه أي منهما منفردًا. أما صفحة الفحص المجهري والتطبيقات المخبرية فتتناول الجانب العملي: ما يظهره مستحضر معين، وكيفية تقييم ملاءمة منتج محدد للطريقة التي تنوي استخدامها.

الجزء من التاريخ الذي لا يزال قائمًا

ثمة تفصيلة في هذه القصة لم تتوقف عن كونها صحيحة في 1902. طوال نحو خمسين عامًا، كان أهم مكون في الصبغة القياسية للملاريا عالميًا شائبة بلا اسم. وُجدت بالمصادفة، واختلفت كميتها بين الزجاجات، وكانت هويتها سرًا تجاريًا خلال جزء من تلك الفترة، وظلت نسبتها موضع نقاش حتى أربعينيات القرن العشرين. لم يكن مستخدمو الصبغة مهملين. لم تكن لديهم وسيلة لمعرفة ما في الزجاجة.

الصورة الحديثة للمشكلة نفسها هي مواصفة لا تصف إلا جزءًا من المادة. المطابقة لمعيار USP هي السبيل إلى أعلى درجة نقاء توفرها السوق، لأنه معيار منشور متكامل، لا قياس منفرد: الهوية، والنقاء، والشوائب العضوية بما فيها أصباغ الآزور، والمذيبات المتبقية، والشوائب العنصرية، والمتبقي بعد الإحراق، والحدود الميكروبية، والذيفانات الداخلية البكتيرية. تحصل Blupreme على أزرق الميثيلين من شركة مصنّعة للمستحضرات الصيدلانية، وتنشر شهادة التحليل الكاملة، بحيث يمكن التحقق من كل بند في تلك القائمة بدلًا من الاكتفاء بادعائه. إن الشهادة التي تعرض نتيجة للمعادن الثقيلة وتصفها بأنها مطابقة لمعيار USP هي النظير المعاصر لزجاجة تحمل عبارة «أزرق الميثيلين المعتّق»: قد تكون كاشفًا جيدًا، لكن الملصق لا يخبرك بما تحتويه.