Metileenbloukleuring: mikroskopiegids en atlas

Metileenbloukleuring maak sellulêre kenmerke wat andersins vaag is, makliker onderskeibaar in helderveldmikroskopie. Dit kan studente help om die kern van 'n wangsel op te spoor of die buitelyne en rangskikking van mikroörganismes te ondersoek. 'n Blou voorwerp is egter 'n waarneming. Om die organisme te benoem, dit te meet en te besluit of dit op siekte dui, is afsonderlike take.

Die voorbladbeeld illustreer die beginsel van kontras. Die atlas hieronder bevat werklike foto's van onafhanklik gedokumenteerde monsters, met hul oorspronklike broninligting.

Wat maak metileenblou sigbaar?

Metileenblou is 'n basiese kleurstof: die gekleurde ioon daarvan dra 'n positiewe lading. Soos OpenStax in sy bespreking van monsterkleuring verduidelik, tree basiese kleurstowwe in wisselwerking met negatief gelaaide sellulêre materiaal en kan hulle selle teen 'n ligter agtergrond laat uitstaan. In geskikte preparate beklemtoon metileenblou streke wat ryk aan nukleïensure is, asook ander strukture wat die kleurstof bind.

By eenvoudige kleuring verskaf een kleurstof die kontras. Verskillende organismes kan gevolglik blou lyk sonder dat hulle dieselfde organisme is. Die nuttige vrae is aanvanklik beskrywend: is die voorwerpe rond of langwerpig, afsonderlik of gegroepeer, eweredig gekleur of intern gedifferensieer? Lees oor die onderskeid tussen eenvoudige kleuring en Gram-kleuring voordat jy kleur as 'n klassifikasieresultaat interpreteer.

Kontras en resolusie verskil. Kontras help om 'n voorwerp van sy omgewing te onderskei; resolusie onderskei besonderhede wat naby mekaar lê. 'n Donkerder beeld waarborg nie dat meer strukture onderskei kan word nie. Ook behoort nie elke donker korrel as 'n organel benoem te word nie.

Ongekleurde preparate, gekleurde natpreparate en uitstrykpreparate

'n Ongekleurde, of natiewe, natpreparaat bied 'n beeld sonder bygevoegde kleurstof, hoewel verwydering uit die oorspronklike omgewing steeds die monster verander. By 'n gekleurde natpreparaat word reagens bygevoeg terwyl die materiaal in vloeistof onder 'n dekglas bly. Vir 'n gefikseerde uitstrykpreparaat word materiaal op 'n voorwerpglas versprei en 'n gespesifiseerde fikseringsmetode gebruik voordat verdere verwerking plaasvind. OpenStax se oorsig van voorbereiding onderskei natpreparate van fiksering en verduidelik waarom gefikseerde organismes nie meer 'n beeld van normale beweging of metabolisme bied nie.

Hierdie preparate beantwoord verskillende vrae:

Preparaat	Nuttige waarneming	Wat die beeld nie op sy eie kan vasstel nie
Ongekleurde natpreparaat	Beweging, buitelyne, materiaal wat van nature sigbaar is	Identiteit op grond van beweging of vorm alleen
Gekleurde natpreparaat	Kontras tussen strukture wat die kleurstof bind en hul omgewing	Of die reagens normale fisiologie onveranderd gelaat het
Gefikseerde, gekleurde uitstrykpreparaat	Morfologie wat ná 'n omskrewe voorbereiding behoue bly	Hoe die oorspronklike lewende monster opgetree het
Benoemde differensiële metode	'n Gespesifiseerde kleuringsreaksie met toepaslike kontroles	Spesie-identiteit of diagnose sonder die metode se breër bewysmateriaal

Vir 'n vergelyking in die klaskamer, dokumenteer 'n ongekleurde preparaat voordat jy 'n afsonderlik gekleurde preparaat ondersoek wat volgens die onderrigprotokol gemaak is. Hou beligting en beeldopname-instellings vergelykbaar. Indien twee verskillende selle gefotografeer word, beskryf hulle as voorbeelde, nie as 'n voor-en-na-rekord van een sel nie.

Mikroskopie-atlas: drie werklike gekleurde monsters

Hierdie atlas is 'n oorspronklike keuse en interpretasie van drie mikrograwe onder oop lisensies. Die bronskrywers identifiseer die monsters en kleurstowwe. Ons het nie hul monsters onafhanklik geverifieer nie. Die beelde word sonder uitsnyding as verlieslose WebP-omskakelings weergegee, sonder bygevoegde kenmerke of kleurveranderings.

Plaat 1: menslike wangselle

Werklike wangselle wat met metileenblou gekleur is, met donkerder kerne en oorvleuelende selbuitelyne.

Monster: menslike wangselle. Kleurstof: metileenblou. Vergroting: 400×, soos deur die fotograaf vermeld. Skaalbalk: nie beskikbaar nie; die bron verskaf geen gekalibreerde pixelgrootte nie. Foto deur Fritzmann2002, 2017, uit Menslike wangselle (metileenbloukleuring), gelisensieer onder CC BY-SA 4.0. Hierdie reproduksie behou daardie lisensie.

Begin met 'n afsonderlike sel: sy donkerder kern is makliker van die omliggende blou sitoplasma te onderskei. Ondersoek dan die oorvleuelende selle daaronder. Oorvleueling maak 'n grens moeiliker om te volg en kan 'n plaaslik donkerder streek skep. Gebruik hierdie plaat om te oefen om buitelyne te volg, nie om elke donker kol as 'n kern te tel nie. Die gids vir die waarneming van wangselle werk die oefening vir hierdie spesifieke monstertipe verder uit.

Plaat 2: uieselle

Werklike gekleurde uieselle met langwerpige kompartemente, ongelyke beligting en donker deeltjiemateriaal.

Monster: uieselle, soos deur die bron geïdentifiseer. Kleurstof: metileenblou. Vergroting: “200x” verskyn in die oorspronklike lêernaam; dit is nie onafhanklik bevestig nie. Skaalbalk: nie beskikbaar nie; geen kalibrasie word verskaf nie. Foto deur Alvy16, 2019, uit Uiesel 200x, gelisensieer onder CC BY 4.0.

Die langwerpige kompartemente vorm 'n geordende laag. Vergelyk hul lang, gedeelde grense met die onreëlmatige buitelyne in Plaat 1. Let ook op die opvallende donker materiaal en ongelyke helderheid van die gesigsveld. Die foto stel nie die identiteit van elke donker neerslag vas nie. Dit wys waarom 'n nuttige waarnemingsrekord artefakte en onsekerheid insluit, eerder as om alles wat kleur opneem te benoem.

Plaat 3: gis wat deur die bron as Candida spp. geïdentifiseer is

Werklike gispreparaat wat met metileenblou gekleur is, met dig gegroepeerde ovaal blou voorwerpe.

Monster: Candida spp., volgens die fotograaf. Kleurstof: eenvoudige positiewe kleuring met metileenblou. Vergroting: nie beskikbaar nie. Skaalbalk: nie beskikbaar nie; geen gekalibreerde pixelgrootte word verskaf nie. Foto deur Marta, Wikimedia-gebruiker Martunia.g, 2021, uit Positiewe kleuring met metileenblou 2, gelisensieer onder CC BY 4.0.

Vergelyk die digte blou groepe met die minder diggepakte rande. Afsonderlike buitelyne is makliker om te volg waar voorwerpe minder oorvleuel. Die naam Candida kom uit die bronrekord, nie uit 'n spesie-identifikasie wat op hierdie foto uitgevoer is nie. Hierdie plaat verskaf ook geen lewensvatbaarheidsresultaat nie. Toetse vir gislewensvatbaarheid en respirasie vereis hul eie toestande, kontroles en interpretasie.

Hoe om skaal korrek te lees

Hierdie plate ondersteun visuele vergelyking, nie metings in mikrometers of vergelykings van absolute selgrootte tussen plate nie. Vermelde vergroting herstel nie ontbrekende kamerakalibrasie nie. Wanneer 'n beeld se vertoongrootte verander, verander sy skynbare vergroting.

Vir jou eie beelde moet jy 'n meetkalibrasie vasstel met 'n bekende standaard en die betrokke optiese opstelling. Nikon se gids tot mikrometrie verduidelik hoe 'n voorwerptafelmikrometer arbitrêre beeld- of kruisdraadverdelings in fisiese lengtes omskakel. Teken die objektief, kamerakonfigurasie en kalibrasie aan, en voeg 'n skaalbalk op grond van daardie data by. Moenie 'n skaalbalk uit 'n handboek se gemiddelde selgrootte aflei nie.

Pas die bottel by die metode?

'n Bottel met die etiket metileenblou is nie 'n volledige laboratoriumspesifikasie nie. Kontroleer die konsentrasie en eenhede, oplosmiddel, bykomende bestanddele, beoogde toepassing, lotdokumentasie en instruksies. 'n Reagens se veiligheidsdatablad beskryf gevare; die metode-instruksies bepaal hoe dit vir die beoogde preparaat gebruik moet word.

'n Konkrete voorbeeld is Merck se Löffler-metileenblouoplossing. Die vervaardiger identifiseer dit as 'n mikroskopiereagens en beskryf die rol daarvan as 'n teenkleurstof by suurvaste kleuring. Die vermelde vlambaarheid wys ook waarom “'n blou vloeistof” onvoldoende inligting is om hantering of verhitting te beplan. Daardie eienskappe geld vir dié formulering, nie outomaties vir elke waterige metileenblouoplossing nie.

Net so is eosien-metileenblou-agar 'n geformuleerde kweekmedium. Dit is nie 'n kleurstof vir voorwerpglase wat gemaak word deur gewone metileenblou by 'n monster te voeg nie. Vir 'n ander beeldvormingsdoelwit, vergelyk alternatiewe vir metileenblou in mikroskopie.

Vir 'n beginnersmikroskoopstel, begin met die gedokumenteerde onderrigmetode, bekende voorbereide voorwerpglase en die gespesifiseerde reagens. Indien 'n bottel sy etiket verloor het of die samestelling daarvan nie vasgestel kan word nie, vervang dit met die toepaslike gedokumenteerde reagens. Gebruik oogbeskerming en die hanteringsinstruksies wat vir die werklike formulering verskaf word. Menslike materiaal en onbekende omgewingsmonsters vereis die onderriglaboratorium se prosedures vir monsterhantering en wegdoening; kleuring is nie 'n plaasvervanger vir daardie prosedures nie.

Skryf die waarneming voor die gevolgtrekking neer

“Blou ovaal voorwerpe in groepe” is 'n verdedigbare beskrywing van 'n beeld. “'n Bepaalde infeksie” vereis bewyse wat die beeld nie verskaf het nie. Hou die monster se herkoms, voorbereiding, kleuringsreaksie en identifikasiemetode apart in die notaboek. Daardie onderskeid maak 'n eenvoudige klaskamerbeeld nuttig en voorkom dat 'n aantreklike mikrograaf 'n aanspraak dra wat dit nie kan staaf nie.