Hoe metileenblou selle binnedring: reduksie, heroksidasie en membraanpartisionering

As jy kyk hoe endoteelselle in 'n kweekskaaltjie metileenblou opneem, is die voor die hand liggende verklaring ook die verkeerde een. Die medium verloor sy blou kleur en die selle kry blou korrels; dus moes die kleurstof as die blou molekule deur die membraan beweeg het. Die eksperimente wys anders. Die blou vorm kruis skaars die membraan. Wat wel deurgaan, is die kleurlose vorm, en die blou wat jy binne sien, word ná aankoms binne gevorm.

Dié omkering is belangrik omdat dit bepaal wat kleuring jou kan en nie kan vertel nie. Blou korrels dui op geoksideerde kleurstof wat geheroksideer en in organelle vasgevang is. Hulle weerspieël nie die totale kleurstof in die sel nie, toon nie die gereduseerde poel nie en meet nie die biologiese effek nie. Om te verstaan waarom, volg die drie stappe: reduksie by die oppervlak, diffusie van die gereduseerde vorm, en heroksidasie en vasvanging binne.

Die twee vorme gedra hulle soos verskillende molekules

Geoksideerde metileenblou is 'n plat, positief gelaaide ringstelsel. Dit los in water op, absorbeer lig sterk rondom 600 tot 700 nanometers en lyk blou. Die lading is die kern van die saak. 'n Gelaaide, waterliewende molekule beweeg nie maklik deur 'n lipiedmembraan nie; daarom is die versigtige formulering in die literatuur relatief membraanondeurlaatbaar, nie ondeurlaatbaar nie.

Gereduseerde metileenblou, wat leukometileenblou genoem word, is kleurloos, ongelaai en vetoplosbaar. Verwyder die lading en die membraan hou op om 'n muur te wees. Die gereduseerde molekule diffundeer maklik daardeur, en sodra dit binne 'n meer oksiderende kompartement is, kan dit weer elektrone verloor en terugkeer na die blou, gelaaide, vasgevange vorm. Die redokschemie van die kleurstof is dus ook sy vervoermeganisme. Verander die aantal elektrone en jy verander die deurlaatbaarheid.

Die elektrone vir die eerste stap kom van die sel self. Soogdierselle voer elektronvervoer oor die plasmamembraan uit en beweeg reduserende ekwivalente vanaf intrasellulêre skenkers na buite, na akseptore by die oppervlak. Hierdie transplasmamembraanaktiwiteit is 'n normale selfunksie wat in die meeste seltipes voorkom. Die oppervlakreduktase van endoteelselle wat tiasienkleurstowwe hanteer, gedra hom in een veelseggende opsig soos ander reduktases: dit bly werk in die teenwoordigheid van sianied en asied teen dosisse wat die latere stappe stil lê. Dié skeiding is die spilpunt van die hele verhaal.

Partisionering het eerste gekom en het opname byna verklaar

In 1929 het Marian Irwin by die Rockefeller-instituut 'n eenvoudiger vraag gevra. Miskien is kleurstof se binnedringing bloot partisionering tussen water en die sel se vetagtige lae, en kan 'n chloroformlaag op die laboratoriumbank daardie vetagtige lae naboots. In haar spektrofotometriese penetrasiestudies het sy waterige kleurstofoplossings met chloroform geskud en vergelyk wat na die organiese fase beweeg het met wat lewende algselle binnegedring het.

Twee bevindings uit daardie werk verdien steeds aandag. Eerstens het kommersiële metileenblou-oplossings trimetieltionien bevat, wat nou Azure B genoem word. Dié onsuiwerheid het vinniger as metileenblou self binnegedring, veral by alkaliese pH waar die lipiedoplosbare vryebasisvorm oorheers. Sommige skynbare opname van metileenblou was eintlik selektiewe opname van Azure B. Tweedens het pH die uitkoms bepaal deur die ionisasietoestand te bepaal, en beskadigde selle het veel meer kleurstof as ongeskonde selle ingelaat. Partisiekoëffisiënte en ladingstoestand het bepaal wat die kunsmatige stelsel en die lewende sel elk opgeneem het. Die ooreenkoms tussen die twee het die idee van nie-waterige lae in die selgrens ondersteun.

Die model was sy tyd vooruit wat lipiede en ionisasie betref, maar dit kon nie onderskei tussen 'n kleurstof wat as homself partisioneer en een wat by die oppervlak chemies omgeskakel word, in vermomming deurgaan en binne weer teruggeskakel word nie. Daardie onderskeid het 'n ander eksperiment vereis, en dit het sewentig jaar later in longendoteel gekom.

Reduksie buite, vasvanging binne

Merker en kollegas het met gekweekte endoteelselle uit beeslongslagare gewerk en 'n driestapvolgorde voorgestel: die geoksideerde kleurstof word op die seloppervlak tot sy kleurlose, lipofiele vorm gereduseer, die gereduseerde vorm diffundeer na binne, en intrasellulêre heroksidasie vorm weer die membraanondeurlaatbare geoksideerde vorm, wat ophoop. Hulle studie van tiasienopname deur endoteelselle het daarna die volgorde getoets deur dit op spesifieke plekke te probeer onderbreek.

Die eerste hulpmiddel was ferrisianied, 'n elektronakseptor wat nie die sel kan binnedring nie. Wanneer oppervlakensieme blou kleurstof buite die sel tot sy kleurlose vorm reduseer, kan ferrisianied daardie elektrone terugneem en weer blou kleurstof in die medium vorm voordat dit ooit deur die membraan gaan. Solank ferrisianied in oormaat teenwoordig was (10 micromolar kleurstof teenoor 50 tot 500 micromolar ferrisianied), het kleurstofopname byna gestop. Eers nadat die ferrisianied opgebruik was, het opname teen sy normale tempo hervat. Die kinetika het dieselfde verhaal op 'n tweede manier vertel. Ferrisianied het teen 'n min of meer konstante tempo verdwyn, wat ooreenstem met 'n bestendige oppervlakreduksievloed wat 'n herwinbare mediator voed, terwyl ekstrasellulêre kleurstof eksponensieel verdwyn het namate sy poel uitgeput is. 'n Konstante vloed saam met 'n poel wat leegloop, beteken dat die ferrisianiedsein voortdurende reduksie weerspieël, nie kleurstofmolekules wat die oplossing verlaat nie.

Die tweede hulpmiddel het die stap van membraankruising heeltemal uitgeskakel. Die groep het toluïdienblou O, 'n naverwante tiasienkleurstof, aan 'n groot poliakrielamiedketting geheg wat te groot was om in enige van die twee oksidasietoestande die sel binne te dring. Selle het steeds die vasgehegte kleurstof gereduseer. Reduksie vereis dus geen intrasellulêre toegang nie. Die betrokke meganisme is aan die oppervlak blootgestel of elektries daaraan gekoppel.

Toe het die skeiding gekom wat die artikel sy titel gee. Sianied en asied teen 2 millimolar het kleurstofophoping sterk onderdruk, en onder die mikroskoop het die donkerblou en pers insluitsels wat normaalweg die kern omring, byna verdwyn. Tog het geen van die twee inhibeerders ekstrasellulêre reduksie vertraag nie: ferrisianiedsiklusse het onverpoos voortgegaan en die polimeer wat nie kon binnedring nie, is steeds gereduseer. Die blokkasie was verder stroomaf. Sianied en asied het intrasellulêre heroksidasie en sekwestrasie gestop, nie oppervlakreduksie nie. Lewensvatbaarheidskontroles het dié vertolking ondersteun, aangesien die selle tydens hierdie behandelings hul sitosoliese merkerensiem laktaatdehidrogenase behou het. Die verlies aan opname was dus nie bloot vergiftiging of membraanbreuk nie.

Een waarskuwing uit die artikel geld steeds. Die blou insluitsels het rondom die kern gelê, maar nie daarin nie, wat strook met oksidasie binne subsellulêre organelle. Die studie het egter nie geïdentifiseer watter organelle dit was nie. Soortgelyke patrone in ander seltipes is op grond van karige bewyse as lisosomaal beskryf. Beskou die vasvanging as vasgestel en die ligging as voorlopig. Lesers wat volg waarheen elektrone vervolgens beweeg, kan verder lees oor mitochondriale elektronvervoer en redokshantering en die breër prentjie van absorpsie en verspreiding volgens toedieningsroete.

Kleuring is nie blootstelling nie

'n Derde studie wys wat gebeur wanneer hierdie opnamelogika met 'n biologiese meetuitkoms saamkom. Scott en kollegas het bevind dat metiel-beta-siklodekstrien, 'n ringvormige suikertorus, direk aan metileenblou bind, met 'n assosiasiekonstante van ongeveer 310 per molar vir die insluitingskompleks teenoor ongeveer 5846 per molar vir kleurstofdimerisasie. In L929-fibroblaste het hierdie binding sowel selkleuring as die stimulering van glukose-opname geblokkeer: voorafinkubasie met die siklodekstrien het blou kleuring voorkom, en die toevoeging daarvan agterna het ontkleuring versnel. Namate die optiese blou sein uit die selle verdwyn het, het die geaktiveerde glukosevervoer in noue samehang afgeneem.

Die outeurs het hierdie korrelasie vertolk as steun vir 'n direkte wisselwerking tussen die kleurstof en 'n proteïen in die glukosevervoerder se aktiveringsroete, eerder as 'n langdurige oksidatiewestresmeganisme. Daardie afleiding is redelik, maar het perke. Die eksperiment identifiseer nie die proteïen nie, toon nie binding aan die vervoerder self nie, en die korrelasie tussen ontkleuring en die verlies aan effek kan nie elke redoksbemiddelde roete uitsluit nie.

Die blywende les gaan oor meting. Optiese kleuring weerspieël sigbare, geoksideerde, selgeassosieerde kleurstof. Dit mis die kleurlose, gereduseerde poel heeltemal; dus kan 'n bleek sel steeds kleurstofekwivalente bevat, en 'n intens gekleurde sel dui op vasgevange geoksideerde kleurstof eerder as totale weefselblootstelling of effekgrootte. Dieselfde waarskuwing geld op groter skaal: om kleuring tussen seltipes te vergelyk, of 'n donker weefselsnit as bewys van hoër blootstelling te beskou, herhaal die oorspronklike fout met die kweekskaaltjie. Opname is 'n siklus van reduksie, diffusie en heroksidasie, en enige enkele momentopname van die blou vorm toon net een deel daarvan. Die praktiese gevolge vir laboratoriumkleuring en -hantering en vir die vertolking van aansprake oor dosis en blootstelling volg direk hieruit.