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紫色血液染色是谁开发的？亚甲蓝、Malachowski、Romanowsky 与 Giemsa
伊红是红色的。亚甲蓝是蓝色的。把两者混合，将混合液涂到干燥的血液涂片上，涂片的一些部分会呈现紫色。
并非所有部分都会如此。在一张质量良好的标本中，白细胞的细胞核呈红紫色，疟原虫内部的染色质也呈相同颜色，而周围的红细胞保持粉红色，细胞质则保持灰蓝色。正是这种紫色，让不同细胞类型能够彼此区分。
两个瓶子里都没有紫色。只有当亚甲蓝的一种特定分解产物在载玻片上与伊红相遇时，这种颜色才会出现，而在 1880 年代和 1890 年代，没有人知道这种产物的存在，更不用说知道它是什么。追寻这种颜色的人使用的是不纯的染料，彼此独立工作，也没有可靠的方法去查明一个瓶子在架子上放了两个月后里面究竟有什么。
这就是为什么标题中的问题有不止一个站得住脚的答案，也解释了为什么答案在 2011 年发生了变化。
随混合物而改变的观察结果
这种染色法并不是一次性发明出来的，而是逐步积累形成的。混合物的每一次改变，都恰好带来一项新的可见信息，而这些信息出现的先后顺序，是理解这段历史最清晰的方式。
| 年份 | 培养皿里有什么 | 你能看到什么 |
|---|---|---|
| 1865 | 苦味酸，由 Wilhelm Erb 首次将这种合成染料用于血液 | 一些红细胞内部出现花边状图案。 |
| 1876 | 亚甲蓝，由 BASF 的 Heinrich Caro 和 Adolf von Baeyer 制得 | 在 Robert Koch 手中可见结核杆菌。血细胞只呈一种蓝色调。 |
| 1880 | 亚甲蓝加酸性品红，即 Ehrlich 的中性染色 | 红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒呈红色，细胞核呈深蓝色，淋巴细胞细胞质呈淡蓝色，并出现同时吸收两种染料的深紫色颗粒。这就是这种细胞被称为中性粒细胞的原因。首次实现白细胞分类计数。 |
| 1888 | 亚甲蓝加伊红。Czesław Chęciński | 可见寄生虫本身：蓝色雏菊状形态（Plasmodium malariae）和镰刀状形态（P. falciparum 配子体）。但看不到它的细胞核。 |
| 1890 | 更多亚甲蓝、更少酒精，再加氢氧化钾。Albert Plehn | 色彩范围更宽、更深，包括玫瑰红色的红细胞和玫瑰色的嗜酸性粒细胞颗粒。但仍然只有红色和蓝色。 |
| 1890 | 伊红加用硼砂碱化的亚甲蓝。Ernst Malachowski | 寄生虫内部的染色质呈红紫色，细胞核可以与细胞质区分。该方法是有意设计的，而且据他所述可以重复。 |
| 1891 | 伊红加取自一个放置超过两个月且已经发霉的瓶子的亚甲蓝。Dmitri Romanowsky | 同样的紫色出现了一次，但其他人无法重复这种方法。 |
| 1898 至 1902 | 氯仿提取的多色染料（Nocht）；甲醇（Jenner）；将沉淀重新溶于酒精（Leishman、Reuter、Wright）；定量染料配合甘油（Giemsa） | 可以按需稳定获得紫色，并制成在另一间实验室中仍能表现一致的产品。Jenner 的版本没有使用多色化染料，因此不会产生紫色。 |
| 1940 至 1943 | Lillie、Roe 和 Wilcox 将各组分分离并逐一测试 | 产生紫色的是 Azure B，而不是整个混合物。 |
最后一列呈现出的规律才是最重要的。每一次进步都扩大了颜色范围，而每一次范围扩大，又让一种新的结构变得可见。紫色并不是这项技术的装饰性结果；它决定了你是只能看出有寄生虫存在，还是能够看出寄生虫由什么构成。染料本身如何从 BASF 的染料工厂进入医学，是一段更长的历史，并有其自身的文献记录。上面的完整过程及每一项背后的来源，都保存在一份带来源链接的贡献者时间线中。
**图：**同样的六种混合物，这里分别画出了培养皿中加入了什么，以及最终产生了什么颜色。圆圈表示染料；其下方的色块表示这些染料能在血液涂片中产生的颜色。1890 之前没有任何一种混合物产生红紫色色块，而此后的混合物都保留了这种颜色。
有意使用硼砂的人
Ernst Malachowski 是 Breslau（今 Wrocław）的一名医生。他的职业生涯主要在私人诊所度过，并与一名同事经营一家小型诊所，同时利用自己的时间开展实验室工作。他于 1857 年 3 月 12 日出生在 Strzelno，在 University of Breslau 学习医学，并于 1882 至 1887 年在 All Saints Hospital 担任内科助理医生；当时这家医院是德国第二大医院。
1888 年，他从 Chęciński 和 Plehn 的双重染色法入手。在 1889 年制备的一份标本中，他看到疟原虫细胞核的染色质与细胞质呈现不同的染色效果，但随后却无法重复这一结果。他尝试将亚甲蓝酸化，结果反而更差。随后他尝试用硼砂使其碱化，而这一方法每次都有效。他于 1890 年 6 月 15 日公开演示了这种方法，并在 1891 年 8 月发表了更完整的说明，其中包括使用硼砂的操作。他指出，染色需要二十四小时，而且结果很容易重复。
二十四小时对于诊断实验室来说很长，而且他的论文并没有重点强调寄生虫细胞核的紫红色。无论原因是什么，在 Nocht 于 1898 年再次采用这一做法之前，没有人继续使用有意碱化亚甲蓝的方法。Malachowski 此后也再未发表过有关血液染色的文章。
直到近年，人们对他所知甚少，原因在于档案留存，而不是什么神秘事件。医学文献中几乎没有留下关于他生平的痕迹，而仅存的信息基本都来自同一条路径。他的女儿 Marie 于 1939 年离开德国前往 London，曾在 British Army 服役，后来定居 Canada，她所保存的一批家族文件最终进入了 New York 的 Leo Baeck Institute。她的兄弟 Leo 在 First World War 中阵亡。她的姐妹 Eva 于 1942 年 4 月从 Breslau 被驱逐到 Izbica 中转营，此后再也没有回来。她的母亲 Hedwig 于 1942 年 4 月 22 日自尽，而没有等待同样的驱逐命运。Malachowski 已于 1934 年去世，早于这一切发生。
以这种方式结束的家族历史，也很容易成为一段不再被引用的历史。2011 年发表的两篇论文重新确立了 Malachowski 在这种染色法发展史中的位置；两篇论文都利用了 Poznań 和 Wrocław 的档案文件，以及 Marie 保存在 New York 的家族资料。
一个发霉的瓶子和一位幸运的俄国人
Dmitri Romanowsky 在 St Petersburg 的 Military Medical Academy 学习医学，其职业生涯的大部分时间都在研究疟疾。1890 年，他发表了一种方法，从文字描述来看几乎与 Chęciński 的方法完全相同：未经处理的亚甲蓝和伊红，只是伊红稍多一些。
1891 年 9 月，他发表了让自己成名的方法，而真正关键的细节却埋在操作说明中。他效果最好的结果来自 die vorräthige Methylenlösung，即一份已经放置超过两个月并长有霉菌的亚甲蓝储备液。霉菌和长时间放置使染料发生了部分去甲基化。Romanowsky 并不知道这一点，也无法控制这个过程，因此其他尝试其方法的研究者无法得到紫色。他的论文于 1891 年 6 月在 St Petersburg 提交，所以标准历史叙述通常把 1891 年视为发现年份。
Malachowski 的公开演示发生在 1890 年 6 月，早了一年多，而且他的方法是有意设计并能够工作的。
为什么这个冠名给错了人
Kristine Krafts、Ernst Hempelmann 和 Barbara Oleksyn 整理了支持 Malachowski 优先权的论证，依据有四点。第一是公开演示的日期：1890 年 6 月，对比 1891 年 9 月。第二是“有意”与“偶然”的区别。第三是 Malachowski 发表了完整方法，包括硼砂，而 Romanowsky 的结果依赖一个无法控制的变量。第四则是一个事实：关于疟原虫细胞核以及显现它的紫色的描述，实际上从文献中消失了七年，因为没有人能重复那个偶然得到的版本。
他们对结论的措辞非常直接。在传记论文中，他们称这种归属为“一场歪曲”，并引用 Ralph Lillie 于 1978 年写下的话：“也许我们应该把这一类染色法称为 Malachowski 染色法”。
这一主张存在争议，就像优先权主张通常都会存在争议一样。与其替争议下结论，不如说明争议本身的结构。关于优先权的争论，首先必须定义所谓“发现”到底是什么。如果发现指的是紫色本身，那么 Malachowski 拥有更早的有记录演示。如果发现指的是公开发表的方法，那么两人都在 1891 年发表，而最终冠名给了 Romanowsky。如果发现指的是对机制的解释，那么两人都不能主张优先权，因为他们都不知道所谓的“成熟”实际上是去甲基化，也都无法解释这种颜色为什么会出现。大众叙述最常忽略的正是最后一点。真正的活性成分是一种当时无人鉴定出的杂质，而第一个有意产生这种颜色的人，依靠的是可重复的经验配方，而不是对这一配方机制的理解。
2011 年的这两篇论文，是目前已发表文献中对 Malachowski 优先权主张最完整的陈述，两篇都可以在 PubMed 免费阅读：长篇综述见 PMID 21235291，传记论文见 PMID 21660627。该综述的 PubMed 记录还列出了一篇评论文章，同年稍后发表于同一期刊的 86(5):366。这也提醒人们，这一论点刚发表就已经在正式出版物中受到质疑。
这场争议并不是化学上的分歧。所有相关研究者对于紫色是什么、由哪些组分产生都没有异议。真正的分歧在于谁最先做到，以及一个无人能够重复的偶然结果是否应当算作真正做到。
后来的那些名字带来了什么
如果 Malachowski 最先产生了紫色，为什么这种染色法却带着 Romanowsky、Wright 和 Giemsa 的名字？
因为一种只能在发明者手中偶尔成功一次的染色法，还不能算是试剂。后来的工作把一种反复无常的混合物，变成了另一个国家的技术人员在星期二也能直接使用的东西。
Nocht 是通过推理找到方向的。在简单的中性染料始终无法给出可靠结果后，他判断紫色一定来自亚甲蓝中某种并非亚甲蓝本身的物质，于是开始寻找它。Unna 已经注意到，老化的亚甲蓝溶液会把肥大细胞颗粒染成红色，并提出染料在成熟过程中会形成一种新物质。Bernthsen 在 1885 年已经证明，碱性条件会从亚甲蓝上脱去甲基，而这些产物就是我们今天所称的 Azures。Nocht 用氯仿提取活性组分，当时只能把它称为 Rot aus Methylenblau，即“来自亚甲蓝的红色”；Michaelis 在 1901 年将其命名为 azure I。Jenner 解决了操作上的问题。将亚甲蓝与伊红形成的沉淀重新溶于无水甲醇，可得到单一稳定溶液，使涂片在染色的同时完成固定，从而结束了热固定。Leishman 和 Reuter 将多色化染料与酒精溶剂结合，使稳定性与紫色同时得到保证。Wright 将 65 °C 下十二小时的孵育加上十天静置，缩短为在流动蒸汽中处理一小时。Giemsa 则彻底停止依赖随机成熟的溶液，改用已知染料的定量配比，并在甲醇中加入甘油，使产品能够经受热带高温。他从未公布自己如何制备纯的 methylene azure。他把这种物质出售给 Leipzig 的 Dr Grübler's laboratory，后者以 azure I 的名称销售，并宣称只有自己的版本才是真正的 Giemsa 染色剂。
这种 Azure 的确切身份至今仍有争议。有些人认为它只是多色化亚甲蓝，另一些人则认为其中富含 Azure B。最终答案来自一场战争。德国染料变得无法获得后，美国 United States Public Health Service 的一个团队——Ralph Lillie、Maurice Roe 和 Aimee Wilcox——发现，最佳染色效果来自三个分离组分：未经改性的亚甲蓝、其去甲基化分解产物 Azure B，以及伊红。Azure B 取代了无法获得的 azure I，而这三个组分至今仍是用于疟疾诊断的染色体系基础。
这三个组分如何在载玻片上相互作用，是另一个问题，也属于另一篇文章。Romanowsky 型染色中的染料作用与化学机制介绍了 Azure B 和伊红各自的作用，以及为什么两者配对后会产生一种单独使用任何一种都不会出现的颜色。显微镜与实验室应用页面则关注实践层面：某种具体制备方式能够显示什么，以及如何判断某一产品是否适合你准备采用的方法。
这段历史中至今仍然有效的部分
这个故事里有一个细节并没有在 1902 年失效。大约五十年间，全球标准疟疾染色法中最重要的一个组分，一直是一种没有名字的杂质。它偶然存在，不同瓶子中的含量不同，其中一段时间它的身份还是商业秘密，而其比例一直争论到 1940 年代。使用这种染色剂的人并不是粗心。他们根本没有办法知道瓶子里究竟有什么。
同一个问题的现代版本，是一份只描述材料部分特征的规格。符合 USP 是获得市场上最高纯度的途径，因为它是一套完整公开的标准，而不是单一测量结果：身份鉴别、纯度、有机杂质（包括 Azure 染料）、残留溶剂、元素杂质、灼烧残渣、微生物限度和细菌内毒素。Blupreme 从一家制药企业采购亚甲蓝，并公布完整的分析证书，因此这份清单中的每一项都可以实际核查，而不是只靠声称。一份只报告某个重金属检测结果却称其符合 USP 的证书，相当于今天的一瓶标着“成熟亚甲蓝”的试剂：它可能完全是很好的试剂，但这个标签并不能告诉你瓶子里究竟有什么。