用于 DNA 和 RNA 染色的亚甲蓝：凝胶与膜应用

一名学生跑完琼脂糖凝胶后用亚甲蓝染色，却在本应出现明亮条带的位置什么也看不到。旁边实验台的一名博士后用同一瓶蓝色染液对 Northern 膜进行染色，三分钟内就得到了清晰的核糖体条带。学生于是认定凝胶实验失败了。其实凝胶并没有失败。两项任务本来就不同，同一种染料在两种情况下具有不同的灵敏度、不同的背景表现，以及不同的后续操作规则。

亚甲蓝 DNA 染色和亚甲蓝 RNA 染色使用相同的化学原理，但目的不同。在凝胶中，染料反映有多少核酸存在于多孔基质内部。在膜上，它用于判断转移是否成功，以及各泳道的上样量是否均匀。一旦明确这一区别，操作方案、检测限和兼容性限制就很容易理解。

简短答案

亚甲蓝是一种平面型阳离子染料，通过多种作用方式与核酸进行非共价、可逆结合，包括对磷酸基团的静电吸引、插入碱基对之间，以及与小沟结合。关键就在于这种可逆性。条带可以在可见光下染色和记录，然后脱色或纯化，以便进行克隆、杂交或再次探测。

对于双链 DNA 的亚甲蓝琼脂糖凝胶染色，标准快速配方是在水中使用 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL)，染色约 15 minutes，再用水脱色约 15 minutes，并在白光箱上观察。对于膜，经典 Northern blot 配方是在接近 pH 5.2 的乙酸钠溶液中使用 0.02 to 0.04 percent 染料，在转移和固定后染色数分钟，然后用水冲洗，并在杂交前彻底脱色。其灵敏度有限：条件良好时，每条凝胶条带需要 tens to hundreds of nanograms，而较保守的指南列出的范围是 0.5 to 1 microgram。这比溴化乙锭和 SYBR 染料所需的量高出多个数量级。对于膜，不存在实用的单一转录本检测限，因为这种染色主要显示高丰度核糖体 RNA 和总上样物质。不要用零售补充剂溶液替代任何一种配方。经过验证的方法假定使用分析级染料、成分明确的缓冲液，并且在涉及 RNA 时采用无 RNase 操作。

结合机制，以及容易产生误解的地方

一个实用的模型包含三部分。第一，带正电的环系会受到带负电的磷酸骨架吸引。光谱学研究发现，在低盐条件下，这种静电作用占主导地位；而建模和分子动力学研究表明，对于双链 DNA，插层和小沟结合也都是稳定的结合模式，相关内容总结于一项关于亚甲蓝与 DNA 结合的光谱学研究。第二，亚甲蓝确实存在一定的 GC 偏好；建模更倾向于 CpG 和 GpC 位点，实验也在亚甲蓝插层偏好研究中发现其更偏向与富 GC 双链结合，但 AT 双链同样能够结合。常规染色并不具有序列特异性。第三，单链 DNA 和 RNA 主要通过静电作用，以及与暴露碱基和双链区域发生堆叠来结合，因此染色强度会随长度、序列和二级结构而变化。

由此会产生两个结果。由于结合是非共价的，染料会被洗脱。聚丙烯酰胺中的条带会迅速褪色，除非专门进行固定；专门的永久固定变体之所以存在，正是因为普通染色本身是暂时性的，具体可见 Soto 和 Draper 关于 PAGE 凝胶的描述。由于该染料还是一种光敏剂，在有氧条件下长时间接受强光照射时，已染色 DNA 中的鸟嘌呤可能被氧化，最终造成链切口；这一机制在亚甲蓝敏化的鸟嘌呤氧化研究中有详细说明。短时间使用白光观察，可以避免经典溴化乙锭流程中众所周知的 UV 损伤，因此对于制备性回收确实具有优势。可见光更温和，但并非完全无害。如果 DNA 将用于克隆，应尽量缩短照明时间。关于这一注意事项背后的更广泛光化学原理，请参阅亚甲蓝光化学中的两条途径。关于解释为什么氧化态能够结合而还原态不能结合的氧化还原对和电荷状态，请参阅亚甲蓝结构与性质的化学原理。

任务一：凝胶内部染色

凝胶染色回答的是一个问题：这个条带中是否有足够的核酸，可以用肉眼看到。琼脂糖中的双链 DNA 是研究最充分的情况。Flores 及其同事最初提出的亚甲蓝凝胶方法在 1 percent agarose 上验证了 0.02 percent 快速方案，并证明染色后仍可成功回收和克隆。同一供应商方案也出现在 IBI Scientific 亚甲蓝产品页面上，其中并列列出了 0.04 percent 膜染色配方和快速凝胶变体。

实际操作流程：

1. 正常进行凝胶电泳。除非已经验证某种改良方法不会影响转移或分辨率，否则应在电泳结束后染色，而不是在电泳过程中染色。
2. 将凝胶浸入蒸馏水配制的 0.02 percent w/v 亚甲蓝溶液中，轻柔摇动，约 15 minutes。
3. 用水多次更换脱色，总计约 15 minutes，直到基质背景降低、条带清晰可见。
4. 立即在白光照明器上拍照。

琼脂糖和聚丙烯酰胺的表现不同。琼脂糖会在基质中保留染料，因此脱色通常是较慢的一步。薄的聚丙烯酰胺凝胶染色很快，但失去染料也很快，这有利于制备性切胶，却不利于长期保存记录。按照成熟的 Current Protocols 风格 PAGE 方法，聚丙烯酰胺中的合成寡核苷酸可以使用同样的 0.02 percent 配方，在 20 to 30 minutes 内通过反复水洗定位。也有报道使用接近 0.0002 percent、配于稀释 TBE 中的极低浓度方案，对制备性寡核苷酸染色数小时，但这类方法的证据基础较弱。

DNA 与 RNA 的差异也很重要。双链 DNA 能产生最强的结构化结合。RNA 和单链 DNA 也能被染色，但信号较弱，而且可预测性较差。对于甲醛琼脂糖 RNA 凝胶，大多数实验室会跳过凝胶内蓝色染色，先把 RNA 转移到膜上，再在膜上染色。这样做是用较弱的凝胶信号换取更清晰的膜信号，同时留下上样记录。

任务二：膜上染色

膜染色回答的是另一个问题：转移是否成功，各泳道之间是否具有可比性。经典应用是 Herrin 和 Schmidt 提出的可逆 Northern blot 染色法，最初使用 50 mM sodium acetate、pH 5.0 中的 0.04 percent 染料染色 2 to 3 minutes，然后用水冲洗，并可在杂交前用 SSPE 中的稀释 SDS 去除染料。

目前广泛使用的现代变体通常如下：

1. 将 RNA 或变性 DNA 转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，然后通过 UV 交联或烘烤固定，避免样品在染色过程中丢失。
2. 可选但常见：将膜置于 5 percent acetic acid 中润湿约 15 minutes。
3. 使用 0.3 to 0.5 M sodium acetate、接近 pH 5.2 的缓冲液，其中含 0.02 to 0.04 percent 亚甲蓝，染色 5 to 10 minutes。
4. 用水冲洗并脱色 5 to 15 minutes，记录图像，然后在杂交前去除残余染料。

带正电荷的尼龙膜是 Northern 实验的主流。硝酸纤维素膜同样适用于相同的乙酸加乙酸盐流程。所得图像用于确认转移是否成功、比较 28S 和 18S 条带（细菌 RNA 则为 23S 和 16S）、标记梯度和标准品，并保留粗略的总 RNA 归一化记录。已有 Northern 方法通过测量染色的核糖体条带进行上样检查，其中包括乳品科学研究中使用亚甲蓝染色核糖体条带进行归一化的方法。Southern 膜也可以采用相同方式进行可视化，但这种染料在 Northern 中作为上样和转移检查手段的应用远为成熟；而且 Southern DNA 在转移前已经变性，因此凝胶中的灵敏度数据不能直接套用。

检测限与背景：蓝色染料的劣势所在

下面的比较有意采用近似值。染色表现取决于凝胶浓度、条带宽度、成像光学条件以及脱色操作。应将每个数字视为一个数量级参考，而不是技术规格。

背景控制决定这种有限的信号是否可用。游离染料颜色非常强，因此对比度来自去除未结合染料，同时又不能把已结合染料洗掉。提高染液浓度通常不会提高灵敏度，主要只会增加脱色时间。应针对实际使用的凝胶、膜和相机进行稀释系列测试，并只使用积分密度与输入量保持比例关系的范围。亚甲蓝可用于半定量的上样归一化。它不是高动态范围的定量检测方法，因为膜容量、转移效率、饱和程度和脱色情况都会在不同泳道间变化。

兼容性限制：染色后还能进行哪些操作

蓝色染色后进行克隆已有实验验证。Flores 及其同事从染色后的琼脂糖凝胶中切取条带，回收 DNA，然后进行连接和转化，并报告其克隆效果优于溴化乙锭加 UV 处理后的样品。最可能的原因是光损伤更少，而不是染料本身带来任何益处。应尽量缩短白光照射时间，并让回收的 DNA 经过常规凝胶提取纯化。

PCR 和测序方面的证据较少。残留染料会结合核酸，因此在进行酶促步骤前应充分脱色并纯化。经过适当纯化的蓝色凝胶 DNA 预计能够正常使用，但不同聚合酶和测序化学体系对染料直接残留的耐受程度尚缺乏充分量化。不要自行假定其兼容性。

只要严格遵循操作顺序，印迹杂交与这种染色兼容：转移、固定、染色、记录、脱色、杂交。这正是 Herrin 和 Schmidt 方法的设计。转移前染色，或者跳过脱色，都属于不同的方法，需要单独验证。去除染料后，可以正常进行标准探针剥离和再次探测。关于同一染料家族在细胞层面的染色，以及为什么固定涂片的逻辑不能直接套用于活细胞方法，请参阅显微染色图谱。

对于制备性琼脂糖，以及通过蓝色染色定位的 PAGE 寡核苷酸，都可以进行条带切取，前提是避免使用永久固定变体。对于可逆结合染料，脱色后进行电洗脱在化学上是合理的，但专门针对亚甲蓝的受控产率数据较少。洗脱后应进行脱盐或沉淀。

反复出现的失败模式

凝胶条带很淡，通常意味着样品质量不足以满足比色染色的检测要求，尤其是短单链靶标或 RNA。应增加上样量、使用新鲜染液，并优先延长染色时间，而不是先提高浓度，同时缩短脱色时间。整个凝胶呈均匀蓝色而没有对比度，通常意味着染色过度或换水次数不足。PAGE 条带逐渐褪色属于预期的化学行为，并不表示染色失败。应迅速拍照。膜背景不均通常提示存在折叠、气泡、指纹、摇动不均或局部转移不完整。在没有杂交对照的情况下，不要把这种现象直接解释为上样量不一致。模糊且较弱的核糖体条带可能意味着降解，也可能是转移不完整、总 RNA 过少（典型泳道的上样量为 several to tens of micrograms），或者脱色过度。该染料显示的是高丰度核糖体 RNA，而不是某个特定转录本。特定转录本的检测属于探针的任务。

安全与操作：避免过度表述

亚甲蓝比溴化乙锭更容易处理，但并非无害。当前 MilliporeSigma 安全数据表将该染料归类为急性经口毒性 Category 4，吞咽有害，并要求按照Sigma-Aldrich 亚甲蓝 SDS通过获批准的废弃物处理渠道处置。溴化乙锭具有更强的遗传毒性警示，其中包括其 Sigma-Aldrich 溴化乙锭 SDS所列的疑似生殖细胞影响；其凝胶和溶液也通常作为危险化学废物单独收集，这一点见于 Thermo Fisher 核酸染料指南。两者都应遵守 SDS 和所在机构的规定。干燥染料应密闭并保持干燥，工作染液只能按照方案允许的方式重复使用，染色后的膜应夹在滤纸之间干燥保存，并在条带扩散消失前完成凝胶拍照。

记住实验台上的一句话。凝胶是在高上样量和白光条件下测试样品是否可见。膜是在探针执行高灵敏度检测之前，用于检查转移和上样情况。同一种染料可以完成这两项任务，但它的灵敏度有限、结合可逆，而且操作顺序必须严格遵守。 :::