Xanh methylen mới và nhuộm hồng cầu lưới: một thuốc nhuộm riêng biệt và phương pháp nhuộm tế bào sống

Một sinh viên chuẩn bị đếm hồng cầu lưới, đặt mua xanh methylen, trộn thuốc nhuộm với máu rồi gần như không thấy gì. Một bạn cùng lớp dùng chai có nhãn xanh methylen mới và thấy những sợi màu xanh rõ nét bên trong một phần các hồng cầu. Sinh viên đầu tiên cho rằng chai thứ hai mới hơn hoặc có nồng độ cao hơn. Cả hai suy đoán đều sai. Chai đó chứa một phân tử khác.

Đây là sự nhầm lẫn về khái niệm đứng sau phần lớn những hiểu lầm trong lĩnh vực này. Tên gọi khiến người ta nghĩ rằng xanh methylen mới là một lô xanh methylen được cải tiến. Nhưng xét về hóa học thì không phải vậy. Xanh methylen mới N là một thuốc nhuộm phenothiazin riêng biệt, có số Colour Index riêng, kiểu thế riêng và vai trò được chuẩn hóa riêng trong huyết học. Khi đã làm rõ sự khác biệt này, phần còn lại của phương pháp — vì sao tế bào phải còn sống khi nhuộm, thế nào là một hồng cầu lưới, thể Heinz có vai trò gì và khi nào dùng xanh cresyl sáng — trở nên dễ hiểu.

Câu trả lời ngắn gọn

Xanh methylen mới N, thuốc thử dùng trong huyết học, thường được xác định là Basic Blue 24 trong hồ sơ PubChem về xanh methylen mới, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, công thức C18H22ClN3S. Xanh methylen thông thường là methylthioninium chloride, Basic Blue 9, trong hồ sơ PubChem tương ứng, C.I. 52015, CAS 61-73-4, công thức C16H18ClN3S. Về cấu trúc, xanh methylen mới mang hai nhóm methyl trên vòng và các nhánh ethylamino, trong khi xanh methylen mang các nhóm dimethylamino. Sự khác biệt này làm thay đổi đặc tính nhuộm. Các tài liệu huyết học mô tả xanh methylen thông thường là thuốc nhuộm hồng cầu lưới tương đối kém, còn xanh methylen mới cho màu đậm và đồng đều hơn; sự so sánh này được tóm tắt trong chuyên mục ScienceDirect về xanh methylen mới.

Đúng, xanh methylen mới là một thuốc nhuộm trên sống. Nhuộm trên sống nghĩa là nhuộm tế bào còn sống sau khi lấy ra khỏi cơ thể và trước khi cố định, theo định nghĩa trong bài tổng quan của NCBI về nguyên lý nhuộm trên sống. Cả xanh methylen mới và xanh cresyl sáng đều thuộc nhóm này, và tiêu chuẩn đếm hồng cầu lưới của CLSI đề cập rõ đến xanh methylen mới như một thuốc nhuộm trên sống. Sinh viên đôi khi xếp phương pháp này cùng với nhuộm Romanowsky trên tiêu bản đã cố định. Cách hiểu đó không phù hợp ở đây. Nếu cố định trước, phương pháp sẽ không còn hoạt động.

Với những độc giả đang tìm hiểu các tên thuốc nhuộm dễ nhầm lẫn, bài xanh methyl và xanh methylen giải thích một sự nhầm lẫn khác, rộng hơn, giữa thuốc nhuộm triarylmethan anion và họ phenothiazin cation. Bài tổng quan về nhuộm trong phòng thí nghiệm trình bày nhuộm trên sống bên cạnh các phương pháp trên tiêu bản đã cố định, còn hướng dẫn về hình thái tế bào máu cho thấy vị trí của đánh giá hồng cầu lưới trong phân biệt các tế bào máu nói chung.

Một lưu ý khi tra danh mục: xanh methylen mới còn có một dạng muối kép với kẽm chloride riêng biệt, mang CAS 6586-05-6. Vì vậy, phần phương pháp cần ghi rõ dạng muối và nhà cung cấp, không chỉ tên thông dụng.

Nhuộm trên sống thực sự làm gì

Hồng cầu lưới là hồng cầu non đã mất nhân nhưng vẫn còn RNA ribosom tồn dư. Trong tiêu bản ướt chưa nhuộm, không thể nhìn thấy RNA này. Thuốc nhuộm trên sống đi vào tế bào còn sống và làm RNA kết tủa hoặc kết tụ thành các hạt và sợi màu xanh, tức vật chất dạng lưới-sợi quan sát được dưới vật kính dầu. Do đó, mạng lưới là sản phẩm của quá trình nhuộm, không phải một bộ khung có sẵn đang chờ được tô màu. Đây là lý do các biến số của quy trình — nồng độ thuốc nhuộm, dung dịch đệm, tỷ lệ máu với thuốc nhuộm, nhiệt độ và thời gian — quan trọng không kém tên thuốc nhuộm.

Hệ quả thực hành là phải tuân thủ nghiêm ngặt thứ tự thao tác: trước hết trộn máu đã chống đông với thuốc nhuộm, ủ, sau đó làm tiêu bản và quan sát khi chưa cố định, không nhuộm đối màu. Cố định trước khi nhuộm, hoặc dùng thuốc nhuộm đối màu che khuất các sợi nhạt, sẽ phá hủy thông tin cần thiết cho việc đếm.

Quy trình thực hành đếm hồng cầu lưới bằng xanh methylen mới

Không có một công thức duy nhất áp dụng cho mọi trường hợp, vì vậy cần báo cáo công thức đã sử dụng. Ba biến thể được ghi nhận dưới đây cho thấy phạm vi khác nhau của phương pháp.

Quy trình cổ điển kiểu Brecher dùng xanh methylen mới khoảng 0.5 phần trăm cùng kali oxalat, trộn theo thể tích bằng nhau với máu chống đông EDTA đã được trộn đều, rồi ủ khoảng 10 đến 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi trộn lại nhẹ nhàng, làm tiêu bản phết mỏng kiểu nêm, để khô tự nhiên và quan sát khi chưa cố định dưới vật kính dầu 100x. Quy trình đếm hồng cầu lưới của NCBI mô tả các bước này và khung đếm được sử dụng kèm theo.

Biến thể Dacie và Lewis dùng xanh methylen mới 1.0 phần trăm trong dung dịch muối citrate, trộn với 2 đến 4 phần thể tích máu và giữ ở 37 C trong 15 đến 20 phút trước khi làm tiêu bản. Một triển khai hài hòa hóa gần đây cho quy trình CLSI H44 dùng dung dịch loãng hơn, ở mức 0.1 phần trăm trong dung dịch muối đệm phosphat có pH 7.4, ủ ở 20 C trong 10 phút và không cố định, như được báo cáo trong nghiên cứu hài hòa hóa NMB năm 2026.

Các biến thể đều dùng chung quy tắc đếm. Xác định một tế bào là hồng cầu lưới khi có ít nhất hai hạt hoặc đoạn sợi riêng biệt bắt màu xanh, qua đó loại trừ cặn thuốc nhuộm đơn độc. Trong xét nghiệm thường quy, đếm ít nhất 1,000 hồng cầu và báo cáo hồng cầu lưới dưới dạng tỷ lệ phần trăm. Khi tỷ lệ thấp, yêu cầu thống kê đòi hỏi phải đếm nhiều tế bào hơn. Một bài tổng quan về phương pháp CLSI H44 lưu ý rằng khi tỷ lệ hồng cầu lưới gần 1 phần trăm, cần khoảng 4,400 tế bào để đưa biến thiên do đếm xuống 5 phần trăm, theo bài tổng quan CLSI H44 trên De Gruyter. Đĩa thị kính Miller giúp việc đếm số lượng lớn trở nên khả thi. Hãy lọc hoặc pha mới thuốc nhuộm, vì kết tủa có thể trông giống các thể vùi dạng hạt.

Thể Heinz trong cùng tiêu bản

Cùng một tiêu bản nhuộm trên sống cũng có thể cho thấy thể Heinz, là những khối hemoglobin bị oxy hóa và biến tính kết tụ lại, chứ không phải RNA tồn dư. Trong tiêu bản dùng xanh methylen mới, chúng xuất hiện dưới dạng các thể tròn, thường đơn độc và nằm gần màng, bắt màu xanh nhạt hơn vật chất dạng lưới-sợi. Chúng khó được bảo toàn qua bước cố định và nhuộm đối màu, vì vậy cần quan sát tiêu bản chưa cố định. Một quy trình gần đây dùng 20 microlit máu chống đông EDTA với 20 microlit xanh methylen mới 1 phần trăm và ủ trong 15 phút đã định lượng các tế bào có thể Heinz trong số 250 hồng cầu, theo nghiên cứu trên PMC báo cáo quy trình đó.

Hai điểm phân biệt giúp tránh đọc sai. Thứ nhất, tím methyl và tím tinh thể nhuộm thể Heinz đậm hơn xanh methylen mới, như được ghi nhận trong chuyên mục ScienceDirect về thể Heinz. Xanh methylen mới là lựa chọn thuận tiện khi đánh giá đồng thời hồng cầu lưới và thể Heinz, chứ không phải thuốc nhuộm chuyên biệt mạnh nhất cho thể Heinz. Thứ hai, các thể vùi HbH ở người mang đặc điểm alpha thalassemia tạo ra nhiều chấm nhỏ khắp tế bào sau khi nhuộm trên sống, trong khi thể Heinz điển hình ít hơn, lớn hơn và thường gắn với màng. Cặn thuốc nhuộm là yếu tố gây nhầm lẫn thứ ba: chúng nằm ngoài mặt phẳng lấy nét của tế bào và thay đổi giữa các vi trường.

Xanh cresyl sáng so với xanh methylen mới

Cả hai đều là thuốc nhuộm trên sống dùng cho hồng cầu lưới, nhưng quá trình chuẩn hóa ưu tiên một loại. Phương pháp đếm hồng cầu lưới CLSI H44-A2, được phát triển cùng Hội đồng Quốc tế về Chuẩn hóa trong Huyết học và được liệt kê trên trang tiêu chuẩn CLSI H44, chỉ định nhuộm máu chống đông EDTA bằng xanh methylen mới là phương pháp đối chiếu thủ công. Kiến thức huyết học cổ điển cũng thống nhất về hình ảnh: xanh methylen mới nhuộm các sợi đậm và đồng đều hơn, trong khi xanh cresyl sáng biến thiên nhiều hơn giữa các lô và mẫu.

Vị thế đó cần được hiểu kèm một điều kiện. Hướng dẫn đánh giá máy phân tích của ICSH chấp nhận phương pháp soi kính hiển vi thủ công với xanh methylen mới để đối chiếu tham chiếu, nhưng nhận định phương pháp này mang tính chủ quan và có độ chụm tương đối thấp; các quy trình tham chiếu bằng đo tế bào dòng chảy được ưu tiên khi có sẵn. Một nghiên cứu so sánh 100 mẫu vào năm 2022 ghi nhận xanh cresyl sáng có độ chệch thấp hơn xanh methylen mới so với máy phân tích được dùng trong nghiên cứu, theo bài so sánh các phương pháp nhuộm trên PMC. Có thể đưa ra kết luận vững chắc cho sinh viên như sau: dùng xanh methylen mới làm phương pháp đối chiếu thủ công đã được chuẩn hóa, kiểm chứng mọi phương pháp xanh cresyl sáng tại cơ sở bằng cách so sánh với phương pháp này hoặc với phương pháp tự động, và dù dùng loại nào cũng cần dự kiến kết quả soi kính hiển vi thủ công có độ phân tán lớn hơn. Các tài liệu chuẩn hóa trước đây cũng đề xuất Azure B tinh sạch như một lựa chọn thay thế tinh khiết hơn về mặt hóa học do các lô thuốc nhuộm thương mại có sự biến thiên, theo nghiên cứu của Marshall về Azure B; điều này giải thích vì sao cấp chất lượng thuốc thử vẫn được nhắc đến khi bàn về phương pháp.

Tránh những sai sót thường gặp

Bốn sai sót gây ra phần lớn các tiêu bản không đạt. Đặt mua xanh methylen thông thường thay vì xanh methylen mới N khiến màu nhuộm yếu do bản chất hóa học, không phải do kỹ thuật. Cố định hoặc nhuộm đối màu trước khi đọc làm mất tín hiệu nhuộm trên sống. Đếm kết tủa thuốc nhuộm như các hạt làm tăng giả kết quả; quy tắc hai hạt và thuốc nhuộm đã lọc giúp ngăn ngừa điều này. Đếm quá ít tế bào khi tỷ lệ hồng cầu lưới thấp tạo ra một con số có vẻ chính xác nhưng có khoảng tin cậy rộng. Mỗi sai sót đều có cùng một biểu hiện: người soi kính hiển vi đổ lỗi cho kính hiển vi về điều đã được quyết định từ bước dùng thuốc thử.