Xanh methylen làm chỉ thị kỵ khí và oxy: sự đổi màu chứng minh điều gì

Một kỹ thuật viên đóng kín bình kỵ khí, kiểm tra que chỉ thị xanh methylen qua nắp và thấy điều mình mong đợi. Que đã chuyển từ xanh sang trắng. Cô ghi nhận lần chạy là kỵ khí rồi tiếp tục công việc. Hai ngày sau, một đĩa không có gì mọc, trong khi một ống canh thang kín trong cùng bình lại có dấu hiệu tiếp xúc với oxy. Que chỉ thị đã phản ánh đúng. Cô đã hỏi nó sai câu hỏi.

Đây là sự nhầm lẫn về khái niệm. Chỉ thị kỵ khí xanh methylen thuộc khái niệm oxy hóa-khử, không phải khái niệm vô trùng hay xác nhận toàn bộ hệ thống. Khi phân biệt rõ điều đó, que chỉ thị trở thành một công cụ chính xác và trung thực với nhiệm vụ giới hạn.

Khái niệm: một cặp oxy hóa-khử thuận nghịch

Xanh methylen hòa tan tồn tại ở hai trạng thái. Dạng oxy hóa là cation màu xanh quen thuộc. Dạng khử, gọi là leucomethylene blue, không có màu. Ở pH gần trung tính, bán phản ứng giản lược là một cation màu xanh cộng một proton cộng hai electron tạo ra một phân tử leuco không màu. Thế hình thức gần mức dương 11 millivolts so với điện cực hydro tiêu chuẩn ở pH 7, nằm trong khoảng mà nhiều hệ khử có thể đạt tới và oxy có thể đảo ngược.

Sự khử cần thế oxy hóa-khử cục bộ thấp. Chỉ loại bỏ oxy không phải lúc nào cũng đủ. Các nghiên cứu ban đầu về điều kiện kỵ khí phát hiện rằng xanh methylen trong nước đơn thuần không có oxy vẫn giữ màu nếu không có chất khử; hỗn hợp canh thang dextrose với khoảng 0.01 phần trăm thuốc nhuộm dễ mất màu ở 37 C, trong khi cùng hỗn hợp đó giữ ở 4 C vẫn xanh suốt một ngày, như được báo cáo trong các thí nghiệm về mô tươi và điều kiện nuôi cấy kỵ khí. Nhiệt độ, pH, glucose, ascorbate, thioglycollate và hoạt động khử của vi sinh vật đều quyết định liệu electron có sẵn hay không.

Sự tái oxy hóa chỉ cần oxy. Khi không khí tiếp xúc với dạng leuco, dạng này chuyển lại thành màu xanh. Các chỉ thị được thiết kế hiện đại khai thác chính chu trình này: thuốc nhuộm cộng chất khử cộng nền ổn định, không màu khi oxy thấp và xanh trở lại khi tiếp xúc với không khí, như được chứng minh trong một chỉ thị oxy xanh methylen lai dựa trên thuốc nhuộm, chất khử, chất hoạt động bề mặt và đất sét. Mẫu thử đó sử dụng thuốc nhuộm 0.01 millimolar với ascorbate hoặc glucose 2.0 millimolar ở pH 11, chuyển sang không màu khi oxy ở gần mức 0.5 phần trăm thể tích và phân biệt được mức oxy dưới 0.1 phần trăm với trên 0.5 phần trăm trong buồng thử nghiệm.

Vì vậy, nguyên lý hoạt động rất đơn giản. Màu xanh nghĩa là vùng chỉ thị đang ở trạng thái oxy hóa. Không màu nghĩa là vùng chỉ thị đã đạt điều kiện khử và oxy thấp. Sự thay đổi này thuận nghịch, cục bộ và mang tính hóa học. Tự nó không cho biết điều gì về vi sinh vật.

Cách que chỉ thị xanh methylen hoạt động trong bình kỵ khí

Que chỉ thị xanh methylen dùng cho bình kỵ khí là một vùng phản ứng nhỏ được đặt trong khí quyển của bình, ở nơi có thể quan sát mà không cần mở bình. Các dạng sản phẩm thương mại khác nhau gồm que giấy, viên được hòa tan hoặc làm ướt khi thiết lập và các loại giấy lai mới hơn. Một số cần một giọt nước cất để kích hoạt vùng phản ứng. Một số khác là thiết bị dạng khô và phải luôn được giữ khô. Cần tuân theo tờ hướng dẫn của đúng sản phẩm, vì việc làm ẩm, vị trí đặt và thời điểm đọc đều là một phần của quá trình hóa học.

Trong thực tế, kết quả được đọc theo hai trạng thái. Màu xanh nghĩa là oxy hoặc điều kiện chưa đủ tính khử vẫn tồn tại tại que. Màu trắng hoặc không màu nghĩa là điều kiện oxy hóa-khử kỵ khí đã được thiết lập tại que. Một số loại giấy thương mại có thêm sắc tố nền đỏ, nên trạng thái cuối khi được khử có màu hồng thay vì trắng. Hãy biết sản phẩm của bạn quy định trạng thái cuối nào trước khi đánh giá.

Thời gian thay đổi tùy hệ thống. Trong một thiết lập kiểu GasPak, màu bắt đầu nhạt đi trong khoảng một giờ và mất hoàn toàn trong vài giờ, còn một phép so sánh có kiểm soát ở nhiệt độ phòng cần hơn sáu giờ đối với xanh methylen. Trong nghiên cứu đó, thế oxy hóa-khử của môi trường đạt khoảng âm 100 millivolts trong vòng 60 đến 100 phút, từ lâu trước khi thuốc nhuộm đổi màu xong, và thấp hơn nhiều so với âm 200 millivolts vào lúc que hoàn toàn không màu. Chỉ thị phản ứng chậm hơn khí quyển trong bình. Que xanh ở giờ thứ nhất không chứng minh sự thất bại, còn que trắng ở giờ thứ sáu mô tả trạng thái của que tại giờ thứ sáu.

Vị trí đặt cũng quan trọng vì cùng lý do đó. Giữ que trong khoảng không khí phía trên, có thể nhìn thấy qua nắp, tránh xa bề mặt thạch và môi trường nuôi cấy. Que phản ánh môi trường ngay quanh nó. Nếu đặt que áp sát một thành bình lạnh, vùi dưới các đĩa hoặc để nước ngưng tụ thấm vào, nó sẽ phản ánh vi môi trường đó thay vì khí quyển trong bình.

Que chỉ thị cho biết điều gì và không cho biết điều gì

Hãy xem chỉ thị xanh methylen trong bình kỵ khí như một cảm biến tại một vị trí. Nó xác nhận điều kiện oxy hóa-khử và oxy cục bộ tại chính vùng phản ứng của mình, có thể đại diện tương đối cho khoảng không khí phía trên nếu sự trộn và cân bằng đầy đủ. Mọi kết luận ngoài phạm vi đó đều là suy luận, và suy luận cần bằng chứng riêng.

Que không màu không xác nhận tính vô trùng. Vô trùng là không có sinh vật sống, được chứng minh bằng quy trình tiệt trùng đã được thẩm định và các đối chứng xác nhận bằng nuôi cấy. Một bình có thể hoàn toàn kỵ khí mà vẫn bị nhiễm, hoặc hoàn toàn vô trùng mà vẫn có oxy.

Que không xác nhận mọi phần của hệ thống nuôi cấy. Oxy hòa tan trong một ống kín, oxy bị giữ trong lớp thạch sâu, các gradient trong bình xếp quá nhiều vật chứa và một chỗ rò xuất hiện sau khi đọc đều nằm ngoài khả năng phát hiện của một que. Các thí nghiệm về phân bố không gian cho thấy những vùng màu xanh và không màu nằm cạnh nhau trong cùng một bình, nơi sự xâm nhập của oxy và hoạt động khử cân bằng theo những cách khác nhau. Một điểm không thể xác nhận toàn bộ một thể tích.

Que không chứng minh điều kiện kỵ khí được duy trì liên tục. Một que được đọc một lần lúc thiết lập không cho biết gì về giờ thứ hai mươi. Các nghiên cứu gần đây về chất lượng kỵ khí cảnh báo rằng chỉ thị hóa học mô tả khí quyển tại thời điểm được đọc và có thể trông đạt yêu cầu dù vẫn còn một lượng oxy dư thấp. Việc ghi nhận liên tục hoặc tại các mốc kiểm tra, chứ không phải một lần nhìn vào trạng thái cuối, mới liên hệ được kết quả của que với quá trình ủ.

Để tìm hiểu phần hóa học đi kèm sự đổi màu, xem cách xanh methylen luân chuyển giữa trạng thái oxy hóa và trạng thái khử. Để hiểu rộng hơn về cách oxy ảnh hưởng đến việc xử lý mẫu, xem nội dung về kiểm soát oxy trong công việc hiển vi và nuôi cấy.

Một sơ đồ để đặt cạnh bình

Hình dưới đây cô đọng bài viết thành một tài liệu tham khảo dùng tại bàn thí nghiệm. Ba trạng thái của cùng một que, hai chiều của phản ứng và ranh giới giữa bằng chứng từ chỉ thị với việc xác nhận hệ thống.

Những dạng lỗi khiến que vẫn xanh hoặc tạo cảm giác yên tâm sai lệch

Phần lớn các lỗi thuộc năm nhóm. Mỗi nhóm có dấu hiệu riêng.

Bình hoặc túi bị rò liên tục đưa oxy vào vùng phản ứng. Que giữ màu xanh hoặc xanh trở lại sau khi nhạt màu. Kiểm tra nắp, gioăng, kẹp và các bề mặt làm kín trước khi quy lỗi cho quá trình hóa học.

Bộ tạo khí đã hết khả năng hoạt động hoặc được kích hoạt sai sẽ không loại bỏ được oxy. Trong các hệ thống cũ kích hoạt bằng nước, không có ngưng tụ vào khoảng 10 đến 15 phút và nắp không ấm lên vào khoảng 20 đến 40 phút là những dấu hiệu cảnh báo sớm đối với hệ thống đó. Gói tạo khí có công suất quá nhỏ trong một bình chứa quá nhiều vật cũng gây lỗi tương tự.

Chất xúc tác bị đầu độc chỉ áp dụng cho các hệ thống hydro cộng palladium kiểu cũ, trong đó palladium giúp hydro và oxy kết hợp thành nước. Độ ẩm và hydro sulfide làm suy giảm chất xúc tác. Nhiều gói tạo khí hiện nay hoàn toàn không dùng palladium, nên không áp dụng cách khắc phục này cho hệ thống không phù hợp.

Que bị suy giảm chất lượng hoặc xử lý sai có thể hỏng mà không có dấu hiệu rõ ràng. Thuốc nhuộm và chất khử mất tính thuận nghịch trong quá trình bảo quản; đây là một lý do các công thức lai được phát triển để chống phai màu do ánh sáng và suy giảm khi bảo quản. Loại bỏ hàng hết hạn, hàng có màu ban đầu bất thường và các que bị làm ướt khi cần giữ khô hoặc bị để khô khi cần làm ướt.

Gradient hoặc độ trễ làm người đọc hiểu sai, chứ không làm quá trình hóa học sai. Khoảng không khí phía trên trộn kém, các ống kín có oxy hòa tan và môi trường bán rắn đều duy trì điều kiện riêng lâu hơn so với điều que gợi ý. Que resazurin chuyển qua màu hồng rồi không màu và thường được quảng bá là nhanh hơn, nhưng các ngưỡng của chúng phụ thuộc công thức riêng và không thể áp dụng cho xanh methylen.

Các đối chứng và quy trình đọc đáng áp dụng

Hai đối chứng chi phí thấp giúp phát hiện phần lớn các cách đọc sai. Giữ một que đối chứng mới trong không khí phòng bên cạnh lần chạy. Que xanh methylen hoạt động bình thường sẽ giữ màu xanh ở đó. Một số chỉ thị đóng gói ban đầu có màu nhạt và chuyển xanh khi mở bao bì; bản thân điều này là một phép kiểm tra chức năng. Đồng thời, định kỳ đặt một que mới trong một thiết lập kỵ khí đã được xác nhận trước đó. Que phải đạt trạng thái khử cuối đã được xác nhận trong thời gian do sản phẩm quy định. Nếu một trong hai đối chứng hoạt động bất thường, hãy thay lô trước khi tin vào kết quả đọc trong bình.

Quy trình đọc được xây dựng từ cơ chế hoạt động. Đặt que trong khoảng không khí phía trên, ở nơi có thể nhìn thấy mà không cần mở bình, tuân theo hướng dẫn sản phẩm về tiếp xúc với thành bình và làm ướt. Ghi màu ban đầu, thời điểm đóng kín bình và màu tại mốc kiểm tra do sản phẩm quy định. Nếu cấu tạo bình cho phép, ghi nhận rằng chỉ thị vẫn ở trạng thái khử tại các mốc kiểm tra xác định trong quá trình ủ. Ghi màu cuối ngay trước khi mở. Màu trước khi mở đó là điểm cuối của lần chạy. Sau khi mở, hãy dự kiến que xanh trở lại và đừng để điều đó thay đổi cách đánh giá diễn biến trước đó.

Nếu que vẫn xanh quá thời gian quy định, hãy coi điều kiện kỵ khí là chưa được xác nhận. Kiểm tra theo thứ tự: độ kín, gói tạo khí, chất xúc tác nếu có, độ ẩm và hạn dùng của chỉ thị, rồi chức năng của chỉ thị so với đối chứng trong không khí. Chỉ khi khí quyển trong bình đã được xác nhận mới nên diễn giải việc có mọc hay không mọc, bằng cách sử dụng thiết lập nuôi cấy kỵ khí và các đối chứng vi sinh vật phù hợp với ứng dụng.

Que chỉ thị xứng đáng có tiếng nói quyết định trong phạm vi của chính nó. Dù xanh hay không màu, nó trả lời một câu hỏi về một vị trí tại một thời điểm. Hãy hỏi đúng câu hỏi đó theo lịch, với các đối chứng bên cạnh, và nó sẽ trả lời đáng tin cậy. Nếu hỏi về tính vô trùng, về từng ống hoặc về toàn bộ quá trình ủ chỉ từ một lần nhìn, thì không cơ chế hóa học chỉ thị nào có thể cứu được cách diễn giải đó.