Vì sao xanh methylene được dùng làm thuốc nhuộm đối màu trong nhuộm kháng acid

Một kỹ thuật viên quan sát tiêu bản phết đờm sau khi hoàn tất toàn bộ chuỗi nhuộm. Các trực khuẩn đỏ nổi bật trên nền xanh, và báo cáo được ghi là có thấy trực khuẩn kháng acid. Ngày hôm sau, một tiêu bản khác có nền xanh đồng đều, không có trực khuẩn đỏ, và được báo cáo là âm tính với bệnh lao. Một trong hai báo cáo này đưa ra kết luận vượt quá những gì tiêu bản có thể chứng minh, và đó không phải là báo cáo đầu tiên.

Sự nhầm lẫn nằm ở khái niệm. Kỹ thuật viên xem thuốc nhuộm xanh là một phần của cơ chế hóa học phát hiện, như thể xanh methylene giúp tìm ra vi khuẩn mycobacteria. Thực tế không phải vậy. Khi xanh methylene tiếp xúc với tiêu bản, phép thử đã hoàn tất. Thuốc nhuộm chỉ nhuộm nền để có thể đọc được kết quả. Bài viết này giải thích vai trò của xanh methylene trong nhuộm kháng acid, vì sao dùng màu xanh thay vì màu khác, và những kết luận có thể rút ra từ màu đỏ trên nền xanh.

Câu trả lời ngắn gọn

Nhuộm kháng acid là một phép thử phân biệt dựa trên ba nguyên lý. Carbol fuchsin, thuốc nhuộm chính, được đưa vào mọi tế bào, kể cả vi khuẩn mycobacteria có vách dạng sáp. Cồn acid, chất tẩy màu, loại thuốc nhuộm đỏ khỏi các tế bào thông thường nhưng không lấy được thuốc nhuộm khỏi tế bào kháng acid. Sau đó, xanh methylene, thuốc nhuộm đối màu, nhuộm mọi thành phần đã bị chất tẩy màu lấy đi thuốc nhuộm, khiến tế bào không kháng acid, tế bào vật chủ và các mảnh vụn có màu xanh, trong khi trực khuẩn kháng acid vẫn đỏ. Thuốc nhuộm đối màu tạo ra sự tương phản. Nó không tham gia vào cơ chế hóa học khiến một tế bào có tính kháng acid.

Vai trò của từng bước

Sơ đồ dưới đây cho thấy sự phân chia vai trò. Đọc từ trái sang phải để theo dõi quy trình, và đọc dải phía dưới để nhớ rằng mỗi nhóm phương pháp nhuộm trả lời một câu hỏi khác nhau.

Đầu tiên là sự thấm vào tế bào. Vi khuẩn mycobacteria chống lại các thuốc nhuộm thông thường trong dung dịch nước vì lớp bao của chúng đặc biệt kỵ nước, nên quy trình phải thúc đẩy thuốc nhuộm đi vào. Trong phương pháp Ziehl-Neelsen, việc hơ nóng đến bốc hơi đưa carbol fuchsin chứa phenol xuyên qua vách dạng sáp. Trong phương pháp Kinyoun lạnh, nhiệt được thay bằng công thức thuốc nhuộm chính có nồng độ cao hơn nhiều, và một số biến thể cải tiến không dùng nhiệt bổ sung chất hoạt động bề mặt. Các quy trình nhuộm kháng acid của Hiệp hội Vi sinh học Hoa Kỳ trình bày cả hai công thức cạnh nhau, và chênh lệch nồng độ rất rõ: khoảng 0.3 g fuchsin base trên 100 mL cho phương pháp dùng nhiệt, so với khoảng 4 g cho phương pháp lạnh.

Tiếp theo là sự phân biệt. Cồn acid, thường gồm 3 mL acid hydrochloric đậm đặc trong 97 mL ethanol 95 phần trăm, rửa thuốc nhuộm đỏ khỏi mọi tế bào có vách không tạo ra khả năng kháng đặc biệt. Các tế bào có lớp bao lipid của mycobacteria còn nguyên vẹn giữ lại thuốc nhuộm. Đây là bước quyết định toàn bộ phương pháp, đồng thời là bước nhạy cảm nhất với kỹ thuật thao tác, như phần dưới sẽ trình bày.

Cuối cùng là tạo tương phản. Lúc này, tiêu bản có các tế bào kháng acid màu đỏ trên nền gần như không màu của những tế bào đã bị tẩy màu. Xanh methylene ở nồng độ 0.3 phần trăm w/v giúp nền đó hiện rõ trở lại bằng một màu khác biệt tối đa với màu đỏ. Bước nhuộm đối màu diễn ra ngắn, thường từ 20 đến 30 giây trong phương pháp dùng nhiệt và có thể kéo dài vài phút ở một số biến thể của phương pháp lạnh; thời gian phụ thuộc vào quy trình chứ không phải đặc tính của bản thân thuốc nhuộm.

Vì sao chọn thuốc nhuộm này, và vì sao là màu xanh

Xanh methylene là thuốc nhuộm base dạng cation, nghĩa là ion mang màu của nó có điện tích dương và gắn với các bề mặt mang điện tích âm của vi khuẩn đã bị tẩy màu, tế bào vật chủ và mảnh vụn. Giáo trình Vi sinh học OpenStax mô tả cơ chế điện tích này là nguyên lý chung của thuốc nhuộm base. Nhưng trong trường hợp này, xanh methylene không có tính độc nhất về mặt hóa học. Tím tinh thể và safranin cũng là thuốc nhuộm base. Lựa chọn này dựa trên quang học, không phải hóa học.

Các trực khuẩn đỏ cần một nền có sắc màu tương phản, và màu xanh đối lập với màu đỏ theo cách hữu ích nhất cho kính hiển vi trường sáng. Safranin sẽ là thuốc nhuộm đối màu không phù hợp vì màu hồng-đỏ cuối cùng của nó quá gần với màu carbol fuchsin được giữ lại, làm mất chính sự phân biệt mà quy trình đã tạo ra. Tím tinh thể sẽ tạo nền tím đậm, cạnh tranh sự chú ý với các trực khuẩn đỏ mảnh. Bằng chứng rõ nhất cho thấy vai trò này là tạo tương phản chứ không phải tham gia phản ứng hóa học nằm ở khả năng thay thế: các thuốc nhuộm đối màu xanh lá như xanh malachite và xanh brilliant được dùng trong một số quy trình thú y và quy trình cải tiến, và phép thử vẫn hoạt động, vì bất kỳ sắc màu khác biệt rõ ràng nào cũng thực hiện cùng một nhiệm vụ.

Từ đó có hai hệ quả thực hành. Thứ nhất, công thức tiêu chuẩn không quy định điều chỉnh pH; đừng nhầm dung dịch nước đơn thuần ở nồng độ 0.3 phần trăm này với các công thức kiềm như xanh methylene Loeffler, vốn thuộc một nguyên lý nhuộm khác. Thứ hai, nhuộm quá mức gây bất lợi. Tài liệu mô học cảnh báo cụ thể rằng nền xanh quá đậm có thể che khuất các trực khuẩn ít ỏi, nên giữ thuốc nhuộm phủ trên tiêu bản lâu hơn quy trình cho phép chỉ làm giảm khả năng đọc mà không đem lại lợi ích.

Cơ chế hóa học của vách giúp phép thử hoạt động

Lý do cồn acid có thể phân biệt nằm ở lớp bao của mycobacteria. Lõi cấu trúc của lớp bao này là phức hợp mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan: peptidoglycan liên kết với arabinogalactan, có các đầu phía ngoài mang acid mycolic chuỗi rất dài, tạo thành màng mycomembrane bên ngoài giàu lipid với tính thấm đặc biệt thấp. Bài tổng quan về màng ngoài của mycobacteria trình bày chi tiết cấu trúc này. Hàng rào hoạt động theo cả hai chiều. Nó cản thuốc nhuộm đi vào, vì vậy bước thấm cần nhiệt hoặc thuốc nhuộm chính có công thức mạnh hơn; đồng thời nó cản thuốc nhuộm bị lấy ra, nên cồn acid không loại được carbol fuchsin khi thuốc nhuộm đã vào bên trong. Vi khuẩn thông thường không có lớp bao này và bị mất thuốc nhuộm. Vì vậy, nên hiểu tính kháng acid là hiện tượng do hàng rào lipid tạo nên, không phải do fuchsin liên kết hóa học với acid mycolic.

Cơ chế hóa học này cũng giải thích một điều thường gây thắc mắc: mycobacteria bắt màu kém và không ổn định khi nhuộm Gram, đôi khi xuất hiện dưới dạng chuỗi hạt mờ hoặc bóng tế bào không bắt màu. Vách kỵ nước của chúng hạn chế sự thấm của tím tinh thể. Nhuộm kháng acid không phải là một dạng nhuộm Gram cải tiến. Đây là một nguyên lý phân biệt khác, dựa trên một đặc tính khác của vách, như bài so sánh nhuộm đơn với nhuộm Gram trình bày về hai phương pháp còn lại.

Ba phương pháp, ba câu hỏi

Để tìm hiểu rộng hơn về nhóm phương pháp nhuộm vi khuẩn bằng một thuốc nhuộm, xem tập bản đồ nhuộm hiển vi.

Màu đỏ trên nền xanh không thể chứng minh điều gì

Các trực khuẩn đỏ cho biết vi sinh vật đã giữ lại carbol fuchsin qua bước xử lý bằng cồn acid. Phát hiện này phù hợp với Mycobacterium tuberculosis, nhưng hướng dẫn chẩn đoán bệnh lao của CDC nêu rõ rằng các mycobacteria khác cũng kháng acid, nên việc định danh loài cần nuôi cấy và xét nghiệm acid nucleic, không thể dựa vào màu sắc.

Sai sót kỹ thuật tập trung quanh hai bước rửa. Tẩy màu không đủ khiến vật liệu nền còn đỏ và dễ dẫn đến đọc nhầm dương tính. Tẩy màu quá mức loại bỏ thuốc nhuộm chính được giữ lại yếu và góp phần gây âm tính giả. Nhuộm đối màu quá đậm che lấp các trực khuẩn ít ỏi trong nền xanh. Tiêu bản phết dày, thuốc thử kết tủa và nước rửa bị nhiễm bẩn tạo thêm các hình ảnh giả riêng.

Độ nhạy bị giới hạn bởi lượng vi sinh vật, dù kỹ thuật được thực hiện chuẩn đến đâu. Soi kính hiển vi tiêu bản phết thông thường cần khoảng 5,000 đến 10,000 trực khuẩn trên mỗi mililit đờm, và các tổng quan bằng chứng trước đây của CDC ghi nhận độ nhạy của tiêu bản phết vào khoảng 45 đến 80 phần trăm trong các ca lao phổi được xác nhận bằng nuôi cấy. Vì vậy, tiêu bản phết âm tính không bao giờ loại trừ bệnh lao. Hướng dẫn hiện hành của CDC duy trì nuôi cấy song song với mọi tiêu bản phết và khuyến nghị xét nghiệm khuếch đại acid nucleic trên ít nhất một mẫu bệnh phẩm hô hấp khi nghi ngờ lao phổi và kết quả có thể làm thay đổi cách xử trí.

Thực hành phải tuân theo các quy trình được phê duyệt

Các mô tả phục vụ giảng dạy, bao gồm bài viết này, không cho phép thực hiện công việc lâm sàng. Khi thực hành tại bàn xét nghiệm, hãy tuân theo quy trình thao tác chuẩn đã được phòng xét nghiệm thẩm định, phù hợp với các tài liệu hiện hành của CDC, APHL hoặc CLSI; tài liệu tham khảo về nhuộm kháng acid của CDC trong kho lưu trữ Stacks cho thấy cách các quy trình này quy định thuốc thử và cách đọc kết quả. Làm việc với bệnh phẩm lao đòi hỏi biện pháp ngăn phát tán: tiêu bản phết được chuẩn bị trong tủ an toàn sinh học vì quá trình chuẩn bị tạo khí dung và giọt bắn, và hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm của CDC nêu rằng ngay cả tiêu bản phết đã cố định bằng nhiệt cũng có thể chứa trực khuẩn lao còn sống và vẫn phải được xử lý như vật liệu nhiễm bẩn. Mục trong Thư viện Hình ảnh Y tế Công cộng của CDC về tiêu bản phết nhuộm carbol fuchsin và xanh methylene để tìm M. leprae nhắc nhở hữu ích rằng phạm vi của phương pháp không chỉ giới hạn ở bệnh lao: cùng một sự tương phản đỏ trên nền xanh được dùng bất cứ khi nào cần tìm vi sinh vật kháng acid, và một kết quả âm tính được đọc cẩn thận cũng đáng được ghi nhận.

Đọc tiêu bản đã nhuộm xong

Thuốc nhuộm đối màu thể hiện giá trị trong quá trình soi sàng lọc. Người soi kính hiển vi trước tiên quét ở độ phóng đại thấp và dùng nền xanh để đánh giá chất lượng tiêu bản phết: tế bào phân bố đều, tế bào vật chủ còn nguyên vẹn để lấy nét, không có nhiều kết tủa. Những cấu trúc đỏ nghi là trực khuẩn sau đó thu hút ánh nhìn chính vì không có thành phần nào khác trên tiêu bản mang màu đỏ. Việc xác nhận được thực hiện dưới vật kính dầu, nơi trực khuẩn thật có dạng que mảnh như mong đợi, đôi khi hơi cong hoặc dạng chuỗi hạt, chứ không phải các mảnh cặn thuốc nhuộm đồng nhất.

Nhuộm nền cũng định hướng cách diễn đạt báo cáo. Tiêu bản có trực khuẩn đỏ được báo cáo là có thấy trực khuẩn kháng acid, thường kèm mức phân loại bán định lượng theo thang của phòng xét nghiệm. Tiêu bản không có vi sinh vật đỏ được báo cáo là không thấy trực khuẩn kháng acid, tuyệt đối không ghi là âm tính với bệnh lao. Sự khác biệt này quan trọng vì nền xanh chứng minh rằng quá trình nhuộm đã hoạt động, tế bào đã bắt thuốc nhuộm đối màu và điều kiện quang học đáp ứng yêu cầu, nhưng không cho biết gì về các vi sinh vật có số lượng dưới giới hạn phát hiện. Một trường nhìn chỉ có nền xanh là kết quả hợp lệ về tiêu bản, không phải kết luận về người bệnh.

Hãy nhớ sự phân chia vai trò, và việc viết báo cáo sẽ trở nên rõ ràng. Carbol fuchsin phát hiện các đối tượng nghi ngờ. Cồn acid thực hiện phép thử. Xanh methylene chỉ khiến câu trả lời dễ đọc: màu đỏ là giữ được thuốc nhuộm trước tác động của acid, màu xanh là đã mất thuốc nhuộm đó. Mọi điều khác, từ loài, lượng vi sinh vật đến ý nghĩa lâm sàng, đều đến từ các công việc ngoài tiêu bản.