Giải thích về thuốc nhuộm xanh methylen kiềm Loeffler và xanh methylen đa sắc

Ba chai có thể nằm cạnh nhau trên bàn nhuộm, mỗi chai mang nhãn một dạng xanh methylen khác nhau. Một chai ghi xanh methylen trong nước 1%. Một chai ghi xanh methylen kiềm Loeffler. Một chai ghi xanh methylen đa sắc. Người đang bận làm việc với tay lấy chai gần nhất. Tiêu bản phết sau đó nhuộm quá nhạt, hoặc xanh quá đồng đều, hoặc xuất hiện những sắc tím bất ngờ, rồi kết quả lại bị quy cho mẫu.

Đây là vấn đề về công thức, không phải về mẫu. Ba dung dịch chứa những chất nhuộm có liên quan nhưng dựa trên các nguyên lý nhuộm khác nhau. Một loại là chất nhuộm cation đơn thuần ở pH gần trung tính. Một loại vẫn là chất nhuộm đó nhưng được tăng cường khả năng nhuộm bằng kiềm. Một loại không còn là một chất nhuộm đơn lẻ, mà là hỗn hợp được chủ động oxy hóa. Dùng nhầm loại thì nguyên lý nhuộm cũng thay đổi ngay trong quá trình thao tác.

Câu trả lời ngắn gọn

Xanh methylen thông thường trong nước là mốc tham chiếu: khoảng 1% chất nhuộm trong nước, một thuốc nhuộm cation đơn giản để quan sát hình thái vi khuẩn và soi kính hiển vi nói chung. Xanh methylen kiềm Loeffler bổ sung một lượng nhỏ kiềm loãng được đong chính xác vào dung dịch gốc trong cồn đã pha loãng bằng nước, làm tăng pH và thúc đẩy chất nhuộm cation gắn mạnh hơn vào các cấu trúc có tính axit của vi khuẩn. Xanh methylen đa sắc là xanh methylen được chủ động làm chín bằng quá trình oxy hóa trong môi trường kiềm, nên chai chứa hỗn hợp các chất đồng đẳng đã khử methyl (azure A, azure B, azure C), thionin và tím methylen cùng với xanh methylen còn lại; hỗn hợp này nhuộm các cấu trúc khác nhau thành những sắc màu khác nhau.

Nếu chỉ nhớ một câu: kiềm hóa làm thay đổi cường độ nhuộm, còn tạo đa sắc làm thay đổi màu nhuộm.

Xanh methylen thông thường trong nước: mốc tham chiếu

Công thức đơn giản nhất là xanh methylen hòa tan trong nước, thường ở nồng độ 1% w/v, không có kiềm và không qua oxy hóa. Tiểu phân mang màu là cation methylthioninium với ion đối chloride, một chất nhuộm phenothiazine nhỏ, phẳng, được mô tả trong hồ sơ xanh methylen của PubChem là methylthioninium chloride. Là một cation, nó gắn vào khung phosphate của axit nucleic và các nhóm có tính axit trên thành tế bào vi khuẩn, nhuộm tế bào màu xanh trên nền sáng.

Ưu điểm của nó là tính ổn định, dễ dự đoán. Nhân tế bào và vi khuẩn hiện màu xanh. Độ tương phản ở mức vừa phải. Những vi sinh vật khó nhìn rõ có thể bắt màu yếu, và đó chính là hạn chế mà Loeffler muốn khắc phục. Để tìm hiểu nhóm thuốc nhuộm đơn vi khuẩn rộng hơn mà dung dịch này thuộc về, hãy xem bài tổng quan về nhuộm đơn vi khuẩn. Việc xác định đúng danh tính chất nhuộm vẫn rất quan trọng: xanh methyl là một phân tử hoàn toàn khác, như bài xanh methyl so với xanh methylen giải thích, nên chỉ tìm theo tên màu trong danh mục có thể dẫn đến chọn nhầm nhóm chất nhuộm.

Xanh methylen kiềm Loeffler: cùng chất nhuộm, tác dụng nhuộm mạnh hơn

Công thức Loeffler cổ điển kết hợp dung dịch gốc xanh methylen trong cồn với kiềm loãng trong nước. Các công thức trong giáo trình dùng 0.3 g chất nhuộm trong 30 mL ethanol 95% cộng với 100 mL dung dịch kali hydroxide 0.01% trong nước (hoặc tương đương là 30 mL dung dịch xanh methylen bão hòa trong cồn, 100 mL nước cất và 1 mL KOH 1%), tạo dung dịch làm việc có khoảng 0.3% chất nhuộm ở pH kiềm rõ rệt. Các phiên bản thương mại tuân theo cùng nguyên lý, và danh mục thuốc nhuộm vi sinh của Thermo Fisher liệt kê xanh methylen kiềm Loeffler cùng với các dạng đa sắc và trong nước thành những sản phẩm riêng, có mục đích sử dụng riêng.

Kiềm là yếu tố then chốt. Tăng pH làm các nhóm carboxyl và phosphate trên mẫu mất proton, tăng mật độ vị trí mang điện tích âm, trong khi dung dịch gốc trong ethanol giữ chất nhuộm hòa tan hoàn toàn để nó đến các vị trí đó ở dạng đơn phân. Kết quả là vi khuẩn bắt màu nhanh hơn, đậm hơn so với thuốc nhuộm trung tính trong nước, tạo hình ảnh trực khuẩn và cầu khuẩn xanh đậm quen thuộc trên tiêu bản phết vi khuẩn thường quy. Thời gian nhuộm thường từ một đến ba phút, sau đó rửa bằng nước.

Ứng dụng kinh điển là Corynebacterium diphtheriae nuôi trên môi trường huyết thanh Loeffler: các trực khuẩn mảnh, thường có dạng chùy, với những hạt dị sắc Babes-Ernst chứa polyphosphate dự trữ bắt màu đậm. Sự kết hợp giữa môi trường và thuốc nhuộm có nguồn gốc lịch sử, cả hai đều được ghi nhận là thành tựu của cùng một nhà vi khuẩn học, và độ tương phản của các hạt mang lại giá trị chẩn đoán. Ngoài công việc liên quan đến bạch hầu, thuốc nhuộm này còn được dùng trong vi khuẩn học nói chung cho tiêu bản phết từ mẫu nuôi cấy, để quan sát hình thái Neisseria trên tiêu bản phết lâm sàng, và trong những trường hợp không cần nhuộm Gram nhưng xanh methylen thông thường trong nước lại cho màu quá nhạt. Đây là thuốc nhuộm đơn sắc. Mọi cấu trúc có tính axit đều bắt một sắc độ xanh nào đó. Khi quy trình yêu cầu phân biệt bằng màu sắc, chỉ riêng kiềm không thể đáp ứng.

Một lưu ý thực tế: dung dịch thuốc nhuộm kiềm xuống cấp và tạo kết tủa trong quá trình bảo quản và hấp thụ carbon dioxide. Phòng thí nghiệm thường pha lượng vừa phải hoặc mua dung dịch thương mại và tuân thủ hạn dùng, thay vì cố duy trì một chai cũ đã bắt đầu để lại cặn trên mọi lam kính.

Xanh methylen đa sắc: một tên gọi, nhiều chất nhuộm

Xanh methylen đa sắc bắt đầu từ cùng chất nhuộm nhưng trải qua quá trình oxy hóa có kiểm soát trong môi trường kiềm, trước đây được gọi là làm chín hoặc tạo đa sắc. Quá trình để già trong môi trường kiềm, gia nhiệt với carbonate hoặc oxy hóa bằng các tác nhân như dichromate lần lượt loại bỏ các nhóm methyl khỏi các nhóm thế dimethylamino. Sản phẩm là một hỗn hợp: xanh methylen còn lại cùng với azure B (mất một nhóm methyl), azure A và azure C (khử methyl thêm), thionin (khử methyl hoàn toàn) và các sản phẩm phụ oxy hóa thuộc nhóm tím methylen. Mỗi thành phần có sắc màu và ái lực với mô riêng, nên hỗn hợp tạo nhuộm dị sắc: nhân tế bào, các hạt, mucin và sụn nhận những tông màu khác nhau từ xanh đến đỏ tím.

Đây cũng là cơ chế hóa học đứng sau các thuốc nhuộm máu nổi tiếng. Những nhà nghiên cứu thời kỳ đầu nhận thấy xanh methylen được kiềm hóa nhuộm nhân ký sinh trùng sốt rét thành các sắc tím, nhưng dung dịch đã làm chín trong nước của họ không ổn định và kết tủa chỉ sau vài ngày. Bài tổng quan về cách thuốc nhuộm máu màu tím được phát minh trình bày cách Malachowski và Romanowsky độc lập khai thác hiệu ứng này vào năm 1891, cách methanol được đưa vào để ổn định kết tủa chất nhuộm và cố định tiêu bản phết mà không cần nhiệt, và cách Giemsa sau đó chuẩn hóa hỗn hợp với lượng azure B và eosin được định lượng, dùng glycerol để ổn định. Các thuốc nhuộm kiểu Giemsa hiện đại bắt nguồn trực tiếp từ xanh methylen đa sắc kết hợp với eosin, sự kết hợp tạo ra hiệu ứng Romanowsky. Để tìm hiểu chi tiết về sự kết hợp với eosin và thành phần azure B, xem thuốc nhuộm kiểu Romanowsky và tương tác giữa azure B với eosin.

Vì là một hỗn hợp, xanh methylen đa sắc về bản chất là loại có mức độ chuẩn hóa thấp nhất trong ba loại. Sự cân bằng chính xác giữa các sắc màu phụ thuộc vào phương pháp và mức độ oxy hóa, vì vậy các nhà cung cấp sản phẩm mô học bán nó như một sản phẩm riêng với phép kiểm tra hiệu năng riêng, chứ không phải Loeffler để già. Các ứng dụng điển hình gồm thể hiện dị sắc ở hạt dưỡng bào, mucin và sụn, quan sát chi tiết tương bào và Helicobacter pylori trong lát cắt mô bằng các phương pháp đa sắc kiểu Goodpasture. Đây là lựa chọn đúng khi cần phân biệt bằng màu sắc, và là lựa chọn sai khi quy trình yêu cầu hình ảnh vi khuẩn đơn sắc rõ nét.

So sánh công thức và mục đích sử dụng

Hãy đọc bảng như một quy trình lựa chọn. Nếu mẫu bắt màu quá nhạt, hãy thay đổi cách tiếp cận về pH và chọn Loeffler. Nếu mọi cấu trúc đều bắt màu nhưng không cấu trúc nào khác biệt, hãy thay đổi cách tiếp cận về chất nhuộm và chọn loại đa sắc. Nếu tiêu bản phết nhuộm Loeffler cho thấy các hạt rất rõ nhưng người phụ trách hỏi tại sao nhân và tế bào chất cùng một màu xanh, câu trả lời là không thuốc nhuộm đơn sắc kiềm nào có thể làm được việc phân biệt đó. Yêu cầu này thuộc về nhóm đa sắc và các dẫn xuất thuốc nhuộm máu của nó.

Tránh những nhầm lẫn thường gặp

Hai sai lầm gây ra phần lớn sự nhầm lẫn. Thứ nhất là coi Loeffler có thể thay thế cho xanh methylen thông thường vì cả hai đều trông xanh trong chai. Chúng khác nhau về pH và cường độ nhuộm; dùng thuốc nhuộm trung tính thay cho Loeffler khi quy trình chỉ định loại này sẽ làm mất đúng độ tương phản của hạt mà quy trình được xây dựng để tạo ra. Thứ hai là coi bất kỳ dung dịch xanh kiềm nào đã cũ hoặc vô tình để già đều là loại đa sắc. Để già không kiểm soát tạo ra hỗn hợp không rõ thành phần và nồng độ, trong khi dung dịch đa sắc thực sự được pha chế bằng các phương pháp oxy hóa xác định và, trong dòng thuốc nhuộm máu, được kết hợp với lượng eosin đã định lượng. Lịch sử mang lại bài học rõ ràng: các dung dịch đã làm chín trong nước kém ổn định của những năm 1890 được thay thế bằng công thức ổn định trong methanol chính vì không thể tái lập các hỗn hợp không kiểm soát. Đây là bài học đáng nhớ trước khi nhuộm lam kính phục vụ chẩn đoán bằng một chai không rõ đã để bao lâu.

Việc xác định đúng tên sản phẩm hoàn tất quá trình kiểm tra. Hãy xác nhận sản phẩm trong danh mục (trong nước, Loeffler hay đa sắc), hàm lượng chất nhuộm và ứng dụng dự kiến trên nhãn, thay vì suy đoán từ màu sắc. Ba công thức có chung nguồn gốc nhóm mang màu. Chúng không có chung mục đích sử dụng.