Nhuộm tế bào niêm mạc má bằng xanh methylen: cần quan sát những gì

Một học sinh nhỏ một giọt huyền phù tế bào niêm mạc má lên lam kính, nhìn qua kính hiển vi và gần như không thấy gì. Vài bóng mờ nhạt trôi qua trường nhìn sáng. Em chỉnh nét, rồi tăng ánh sáng, sau đó kết luận rằng lam kính không có gì. Nhưng lam kính không trống. Các tế bào vẫn ở đó. Chúng gần như trong suốt, và chính sự trong suốt là vấn đề mà phương pháp nhuộm này được tạo ra để giải quyết.

Sự khác biệt giữa kỳ vọng và hình ảnh này cần được nêu rõ trước khi bắt đầu quy trình. Người mới thường kỳ vọng kính hiển vi sẽ làm hiện rõ chi tiết như khi máy ảnh phóng to một biển báo ở xa. Kính hiển vi trường sáng thực hiện một việc cụ thể hơn: cho thấy sự khác biệt về hấp thụ ánh sáng. Một tế bào niêm mạc má chưa nhuộm hầu như không hấp thụ ánh sáng, nên gần như không tạo ra sự khác biệt. Xanh methylen bổ sung sự khác biệt đó. Thuốc nhuộm liên kết không đồng đều bên trong tế bào, biến cấu trúc thành độ tương phản. Khi học sinh nắm được khái niệm này, mỗi bước tiếp theo đều có lý do, thay vì chỉ là một thao tác phải làm theo.

Kiến thức nền về cách nhuộm đơn tạo độ tương phản trong phòng thực hành ở trường sẽ hữu ích ở đây, và việc ôn lại cách thiết lập kính hiển vi trường sáng trước khi nhuộm giúp tránh một nửa số tiêu bản không đạt. Cơ sở hóa học của màu sắc được trình bày trong bài giới thiệu về xanh methylen trong hiển vi, giải thích vì sao loại thuốc nhuộm này thường xuyên xuất hiện trên bàn thực hành.

Quy trình trong lớp học

Phương pháp làm tiêu bản ướt dưới đây là lựa chọn mặc định đơn giản hơn cho các lớp học thông thường. Phương pháp này không cần ngọn lửa và không cần bước cố định mẫu. Biến thể phết mẫu có cố định được dùng trong một số tài liệu thực hành bậc đại học có thêm bước để khô trong không khí và cố định nhanh bằng nhiệt, như trong bài thực hành phết tế bào niêm mạc má của North Central Texas College được đăng trên Biology LibreTexts. Tuy nhiên, cố định bằng nhiệt là một thao tác thường dùng trong vi sinh học, không phải điều kiện bắt buộc để quan sát tế bào biểu mô.

Dụng cụ và vật liệu cần có: lam kính và lamen sạch, tăm bông vô trùng dùng một lần (ưu tiên) hoặc tăm dẹt mới, một lọ nhỏ giọt chứa dung dịch xanh methylen trong nước nồng độ 0.5 đến 1 phần trăm, nước cất hoặc nước khử ion, giấy thấm, găng tay và kính hiển vi quang học phức hợp có độ phóng đại tổng 100x và 400x.

1. Súc miệng bằng nước thường. Bước này loại bỏ các mảnh thức ăn có thể bắt màu đậm và làm phân tán sự chú ý khỏi các tế bào.
2. Mỗi học sinh chỉ lấy mẫu từ niêm mạc má của chính mình. Dùng tăm bông vô trùng mới chà nhẹ mặt trong má. Tì nhẹ, không cạo. Dừng lại từ sớm, trước khi có bất kỳ cảm giác khó chịu hay chảy máu nào.
3. Lăn tăm bông qua giữa một lam kính sạch để tạo lớp phết mỏng. Lớp phết mỏng là yếu tố quan trọng nhất quyết định tiêu bản có dễ quan sát hay không. Một lớp cặn trắng dày sẽ bị nhuộm thành khối xanh không thể phân biệt cấu trúc.
4. Nhỏ một giọt xanh methylen lên vùng phết mẫu. Để trong 1 đến 3 phút. Một phút là đủ trong nhiều quy trình thực hành bậc đại học; sổ tay thực hành khoa học lớp IX của NCERT dùng khoảng 3 phút cho tiêu bản tạm thời. Lâu hơn không có nghĩa là tốt hơn, và nhuộm quá mức là lỗi về thời gian thường gặp nhất.
5. Rửa nhẹ bằng nước cất hoặc dùng giấy thấm hút phần thuốc nhuộm thừa, theo quy trình tại cơ sở. Nền nên chuyển sang xanh nhạt, không phải xanh đậm.
6. Hạ lamen theo góc nghiêng để một cạnh chạm trước, rồi từ từ hạ phần còn lại xuống. Cách này giúp tránh bọt khí.
7. Bắt đầu ở độ phóng đại thấp để tìm tế bào, kiểm tra độ nét và đưa mẫu vào giữa trường nhìn, sau đó chuyển sang 100x rồi cuối cùng là 400x. Ở 400x, chỉ dùng núm chỉnh nét tinh.

Nồng độ thuốc nhuộm cần được làm rõ bằng một câu. Các quy trình ở trường thường dùng dung dịch xanh methylen trong nước khoảng 1 phần trăm. Dung dịch gốc đậm đặc hơn hoặc thời gian tiếp xúc dài sẽ làm nền đậm lên nhanh hơn nhân, đảo ngược độ tương phản mà bài thực hành cần có.

Xử lý mẫu niêm mạc má an toàn

Mẫu niêm mạc má có kèm nước bọt và các vi sinh vật bình thường trong khoang miệng, vì vậy hãy coi mọi mẫu phết mới là vật liệu có khả năng lây nhiễm, dù người cho mẫu là những bạn học khỏe mạnh. Hướng dẫn an toàn sinh học cho phòng thực hành giảng dạy của Hiệp hội Vi sinh học Hoa Kỳ nêu các nguyên tắc chung: đánh giá rủi ro trước buổi học, đeo găng tay, bảo vệ mắt khi có khả năng bắn tóe, rửa tay sau buổi học, khử trùng bàn thực hành và xử lý vật dụng dùng một lần bị nhiễm bẩn theo quy trình chất thải sinh học được phê duyệt.

Bốn quy tắc trong lớp học bao quát phần lớn rủi ro. Mỗi tăm bông và mỗi lam kính chỉ dùng cho một người cho mẫu, tuyệt đối không dùng chung. Chỉ tự lấy mẫu, không lấy mẫu cho bạn bên cạnh. Tăm bông và tăm dùng một lần phải được bỏ ngay vào thùng chất thải quy định, không đặt lại lên bàn. Bản thân xanh methylen làm nhuộm màu da và quần áo, đồng thời gây kích ứng mắt, nên cần đeo găng tay và tuân thủ các quy tắc vệ sinh thông thường khi sử dụng thuốc nhuộm. Không mở rộng bài thực hành này sang nuôi cấy bất kỳ thành phần nào từ mẫu phết, và không tự ý cố định bằng nhiệt vật liệu mới lấy từ người ngoài quy trình an toàn của nhà trường.

Cần quan sát những gì và vì sao chúng có hình ảnh như vậy

Ở 100x, hãy tìm các tế bào rộng, dẹt, màu xanh nhạt, có đường bao hình bầu dục hoặc đa giác không đều. Chúng nằm riêng lẻ hoặc thành những lớp chồng lên nhau lỏng lẻo. Mỗi tế bào thường có một đốm xanh đậm hơn. Đốm đó là nhân. Cũng cần chú ý cách chúng sắp xếp: tế bào biểu mô lát giống những viên gạch mỏng, không phải hình cầu, nên rìa của chúng trông giống lớp men rạn hơn là những quả bóng tròn.

Ở 400x, ba đặc điểm hiện rõ. Ranh giới tế bào trông như một đường mảnh đậm hơn bao quanh tế bào. Tế bào chất lấp đầy bên trong bằng màu xanh nhạt đồng đều. Nhân đậm màu và đặc hơn, thường có hình bầu dục, thường nằm gần trung tâm nhưng không phải lúc nào cũng vậy. Yêu cầu học sinh ghi lại cả ba đặc điểm, cùng hình dạng và độ phóng đại, vì đó chính là những nội dung phiếu học tập yêu cầu.

Có một điểm cần chính xác ở đây mà nhiều phiếu học tập trình bày sai. Ranh giới nhìn thấy tương ứng với vùng màng sinh chất, nhưng bản thân màng, một lớp kép lipid dày khoảng 7 đến 10 nanomet, nhỏ hơn rất nhiều so với khả năng phân giải của kính hiển vi ở trường. Những gì học sinh thấy là rìa quang học của tế bào cùng thuốc nhuộm tích tụ tại đó. Cũng cần thận trọng tương tự với các bào quan. Ti thể, lưới nội chất, bộ máy Golgi và ribosome không hiện ra trong tiêu bản này. Kính hiển vi quang học thông thường có thể phân giải đến khoảng 0.2 micromet trong điều kiện tốt, như tài liệu nền về các công cụ hiển vi trong sinh học tế bào của NCBI giải thích, và phần lớn cấu trúc siêu hiển vi có kích thước nhỏ hơn hoặc gần giới hạn đó. Phóng đại rỗng ở mức cao hơn làm hình ảnh lớn hơn mà không bổ sung chi tiết.

Vì sao nhân bắt màu đậm nhất? Xanh methylen là thuốc nhuộm cation, mang điện tích dương trong dung dịch, và liên kết với vật liệu mang điện tích âm trong tế bào, trước hết là axit nucleic. Chất nhiễm sắc tập trung DNA trong nhân, nên nhân tích tụ nhiều thuốc nhuộm nhất. Tế bào chất chứa RNA và các phân tử mang điện tích khác nên cũng bắt màu, nhưng phân tán hơn và nhạt hơn. Điểm cần nhấn mạnh: xanh methylen không phải thuốc nhuộm đặc hiệu cho DNA. Nghiên cứu về sự phân bố của xanh methylen trong tạo ảnh nhân tế bào mô tả sự liên kết của cation với các vùng giàu axit nucleic, còn nghiên cứu định lượng trước đây về sự liên kết của xanh methylen trong các tiêu bản tế bào cho thấy phần lớn thuốc nhuộm đã liên kết gắn với axit nucleic. Vì vậy, nhân đậm màu cùng tế bào chất nhạt màu là một kiểu tương phản, không phải một phép xét nghiệm phân tử.

Những lỗi học sinh sẽ mắc và cách nhận biết

Gần như mọi tiêu bản không đạt đều thuộc một trong năm dạng. Hãy dạy học sinh tìm nguyên nhân từ tiêu bản thay vì làm lại một cách máy móc.

Nhuộm quá mức khiến tế bào và nền cùng đậm màu, làm nhân chìm vào trường nhìn. Khắc phục bằng cách rút ngắn thời gian nhuộm hoặc rửa kỹ hơn. Nhuộm chưa đủ để lại những bóng mờ biến mất khi tăng ánh sáng; tăng thời gian theo từng khoảng ba mươi giây. Lớp phết dày tạo ra những khối chồng chéo đặc, không thể lần theo đường bao; cách khắc phục nằm ở thao tác phết: lần sau dàn mỏng hơn, vì rửa không thể cứu được một đống tế bào. Bọt khí hiện thành những hình tròn hoàn hảo có viền tối sắc nét, khiến người mới phân tâm khi nhầm chúng với cấu trúc tế bào; đặt lại lamen từ từ theo góc nghiêng. Những chấm nhỏ sẫm màu rải trên hoặc quanh tế bào thường là vi khuẩn bình thường trong khoang miệng, như các quy trình ở trường, chẳng hạn quy trình quan sát tế bào niêm mạc má của Ingrid Science, đã lưu ý. Chúng cho thấy khoang miệng có vi sinh vật sinh sống, điều mà học sinh có thể nhớ lâu, nhưng không thể xác định chúng đến cấp loài trong bài thực hành này và không nên vẽ chúng thành các bộ phận của tế bào. Mảnh thức ăn và các sợi chất nhầy bắt màu không đều và rất đậm; bước súc miệng ban đầu nhằm giảm bớt chúng.

Những điều bài thực hành này không thể làm

Đây là hoạt động quan sát phục vụ giáo dục, không phải xét nghiệm chẩn đoán. Không có đặc điểm hình thái tế bào nào trong tiêu bản nhuộm ở lớp học có thể dùng để chẩn đoán nhiễm trùng, ung thư hay bất kỳ bệnh nào, và không nên hiểu bài viết này theo hướng ngược lại. Tiêu bản cho thấy hình dạng, ranh giới, tế bào chất và nhân ở hai độ phóng đại. Nó không cho thấy cấu trúc siêu hiển vi của màng, chi tiết bào quan hay danh tính phân tử. Nêu rõ giới hạn này giúp bảo vệ cả tính khoa học lẫn học sinh: kết quả tốt là một hình vẽ có chú thích đúng, ghi rõ độ phóng đại và thuốc nhuộm, không phải một kết luận về sức khỏe.

Phiếu học tập và ảnh hiển vi có chú thích

Hai tư liệu của dự án dành cho trang này là ảnh hiển vi có chú thích ở trên và phiếu học tập dưới đây. In mỗi học sinh một phiếu, hoặc trình chiếu và yêu cầu học sinh chép các ô vào vở.

Cách sử dụng trong một buổi học 45 phút: mười phút để hướng dẫn an toàn và lấy mẫu, mười phút để nhuộm và làm tiêu bản, mười lăm phút để quan sát và vẽ phác ở cả hai độ phóng đại, mười phút để hoàn thành danh sách kiểm tra và đối chiếu với ảnh hiển vi có chú thích. Các mục trong danh sách kiểm tra được cố ý giữ ở mức thao tác cụ thể. Lớp phết mỏng, thời gian nhuộm đúng, nhân đậm màu hơn tế bào chất, đã ghi độ phóng đại. Học sinh có thể đánh dấu đủ cả bốn mục đã hiểu khái niệm mà bài học muốn truyền đạt: kính hiển vi hiển thị sự khác biệt, còn thuốc nhuộm tạo ra những khác biệt đáng để quan sát.