Bài viết
Nhuộm đơn bằng xanh methylen so với nhuộm Gram: mỗi phương pháp có thể chứng minh điều gì
Một sinh viên chuẩn bị tiêu bản phết từ mẫu nuôi cấy được ghi nhãn E. coli, phủ xanh methylen trong một phút, rửa rồi quan sát qua vật kính nhúng dầu. Các trực khuẩn màu xanh phủ khắp vi trường. Báo cáo thực hành ghi: "Trực khuẩn Gram âm được xác định là E. coli." Quan sát là đúng. Nhưng tiêu bản đó không đủ căn cứ cho kết luận này.
Sai sót nằm ở khái niệm, không phải kỹ thuật. Sinh viên đã xem nhuộm đơn như một phép thử phân biệt. Nhuộm đơn và nhuộm Gram trả lời những câu hỏi khác nhau vì chúng dựa trên các nguyên lý nhuộm khác nhau. Một phương pháp hỏi: có hình dạng nào hiện diện. Phương pháp kia hỏi: thành tế bào phản ứng ra sao khi được thử nghiệm. Nhầm lẫn hai phương pháp thì một tiêu bản được nhuộm đúng vẫn có thể dẫn đến báo cáo thiếu căn cứ.
Bài so sánh này phân biệt rõ hai phương pháp, cho thấy mỗi kết quả cho phép bạn khẳng định điều gì, đồng thời trả lời hai câu hỏi sinh viên thường đặt ra nhất: có thể dùng xanh methylen trong nhuộm Gram không, và nhuộm E. coli bằng xanh methylen thực sự cho thấy điều gì.
Câu trả lời ngắn gọn
Nhuộm đơn bằng xanh methylen làm mọi tế bào có khả năng bắt màu đều có cùng màu xanh, nên chỉ cho thấy hình thái (hình que, hình cầu, hình xoắn) và cách sắp xếp (đơn lẻ, thành đôi, thành chuỗi), không cho biết nhóm Gram. Nhuộm Gram bổ sung iod, bước tẩy màu và thuốc nhuộm đối màu, nên phân biệt vi khuẩn thành Gram dương (tím) và Gram âm (hồng hoặc đỏ) dựa trên khả năng giữ thuốc nhuộm của lớp bao tế bào. Các trực khuẩn màu xanh sau khi nhuộm bằng xanh methylen có nghĩa là "có tế bào hình que hiện diện". Các trực khuẩn màu hồng sau một quy trình nhuộm Gram đầy đủ có nghĩa là "có trực khuẩn Gram âm hiện diện". Nhận định thứ hai có cơ sở vững hơn vì quy trình đã thực hiện thêm một phép thử.
Để tìm hiểu nhóm phương pháp nhuộm vi khuẩn bằng một thuốc nhuộm mà bài viết này đề cập, xem atlas nhuộm hiển vi.
Nhuộm đơn: một thuốc nhuộm, một câu hỏi
Xanh methylen là thuốc nhuộm bazơ (mang điện tích dương). Ion mang màu của nó có điện tích dương và liên kết với các cấu trúc mang điện tích âm trong tế bào, bao gồm axit nucleic và các nhóm axit trên bề mặt, nên tế bào hiện màu xanh trên nền nhạt. OpenStax mô tả nguyên lý nhuộm dương này trong chương về nhuộm. Bản thân cation thuốc nhuộm là ion phenothiazin nhỏ, phẳng được trình bày chi tiết trong tài liệu tham khảo về hóa học của xanh methylen; ion đối clorua không tạo màu.
Quy trình giảng dạy tiêu chuẩn được chủ ý giữ đơn giản: làm tiêu bản phết mỏng, để khô tự nhiên, cố định bằng nhiệt, phủ dung dịch xanh methylen trong nước khoảng 1% trong chừng một phút, rửa nhẹ bằng nước, thấm khô rồi quan sát bằng vật kính nhúng dầu. Một quy trình giảng dạy trên LibreTexts nêu đúng cách dùng dung dịch 1% trong một phút này, đồng thời lưu ý rằng một số phòng thí nghiệm kéo dài thời gian. Không có chất cắn màu, không có chất tẩy màu, không có thuốc nhuộm thứ hai. Chính sự vắng mặt đó là điểm cốt lõi. Với chỉ một thuốc nhuộm và không có bước loại bỏ chọn lọc, mọi tế bào gắn thuốc nhuộm đều có cùng màu.
Với E. coli, vi trường dự kiến gồm các tế bào hình que màu xanh (trực khuẩn), đơn lẻ, thành đôi hoặc thành nhóm nhỏ. Màu xanh đến từ thuốc nhuộm. Hình que là đặc điểm của vi sinh vật. Nhưng sự kết hợp này không xác định được vi sinh vật, vì nhiều loài có hình que và nhiều trực khuẩn bắt màu xanh khi nhuộm đơn. ATCC nêu rõ giới hạn chỉ cho biết hình thái này trong hướng dẫn nuôi cấy vi sinh. Báo cáo đúng sẽ ghi: "quan sát thấy trực khuẩn màu xanh". Mọi nhận định vượt ngoài hình dạng và cách sắp xếp đều cần thêm bằng chứng.
Nhuộm Gram: bốn thuốc thử, một phép thử phản ứng
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm phân biệt. Phương pháp này cho tất cả tế bào trải qua cùng một trình tự và quan sát tế bào nào giữ được thuốc nhuộm đầu tiên, tế bào nào mất màu đó. Các quy trình nhuộm Gram của Hiệp hội Vi sinh học Hoa Kỳ quy định trình tự bốn bước tiêu chuẩn: tím tinh thể (thuốc nhuộm chính), iod Gram (chất cắn màu), cồn hoặc hỗn hợp acetone–cồn (chất tẩy màu), rồi safranin (thuốc nhuộm đối màu).
| Bước | Thuốc thử | Chức năng | Kết quả Gram dương | Kết quả Gram âm |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Tím tinh thể | Thuốc nhuộm chính, nhuộm tất cả tế bào thành màu tím | Tím | Tím |
| 2 | Iod Gram | Chất cắn màu, tạo phức với tím tinh thể | Tím | Tím |
| 3 | Chất tẩy màu | Loại bỏ phức hợp một cách chọn lọc | Vẫn tím | Trở nên không màu |
| 4 | Safranin | Thuốc nhuộm đối màu, nhuộm các tế bào đã bị tẩy màu | Vẫn tím | Hồng hoặc đỏ |
Mô hình giảng dạy tiêu chuẩn giải thích sự phân biệt này qua cấu trúc lớp bao tế bào. Tế bào Gram dương có thành peptidoglycan dày, bị mất nước và giữ phức hợp tím tinh thể–iod trong bước rửa bằng cồn. Tế bào Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng cùng màng ngoài giàu lipid bị chất tẩy màu phá vỡ, nên phức hợp bị rửa trôi và tế bào sau đó bắt màu safranin. Bài tổng quan về nhuộm Gram trên NCBI Bookshelf trình bày cơ chế liên quan đến thành tế bào này. Các chuyên gia bổ sung rằng cơ chế hóa lý đầy đủ phức tạp hơn độ dày thành tế bào đơn thuần, nhưng khi diễn giải kết quả tại bàn thí nghiệm, quy tắc phản ứng vẫn đúng: màu tím nghĩa là giữ được màu, màu hồng nghĩa là đã mất màu rồi được nhuộm đối màu.
Các khung hình minh họa. Đây là hình vẽ cách điệu để so sánh phương pháp, không phải ảnh chụp hiển vi. Màu sắc được đơn giản hóa để giải thích nguyên lý: một màu trong nhuộm đơn, hai màu sau bước tẩy màu của nhuộm Gram.
Có thể dùng xanh methylen trong nhuộm Gram không
Câu hỏi này có hai cách hiểu, và mỗi cách cần một câu trả lời khác nhau.
Cách hiểu thứ nhất: một lần phủ xanh methylen có thể thay thế toàn bộ trình tự nhuộm Gram không. Không. Nếu không có iod, chất tẩy màu và thuốc nhuộm đối màu thì không có bước phân biệt, do đó không kiểm tra được nhóm Gram. Vi trường màu xanh sau khi chỉ dùng xanh methylen là kết quả nhuộm đơn, ngay cả khi chai thuốc nhuộm đặt cạnh các thuốc thử nhuộm Gram. Không ghi nhận đó là kết quả nhuộm Gram.
Cách hiểu thứ hai: xanh methylen có thể thay safranin làm thuốc nhuộm đối màu ở bước 4 không. Về chức năng, nó có thể nhuộm các tế bào đã bị tẩy màu, và một bài tập trong sách giáo khoa dự đoán rằng sau khi thay như vậy, tế bào Gram dương sẽ có màu tím còn tế bào Gram âm có màu xanh. Lập luận này hợp lý vì tế bào Gram âm được tẩy màu đúng cách gần như không màu và sẽ bắt một thuốc nhuộm cation khác. Nhưng đây không phải quy trình tiêu chuẩn. Các quy trình của ASM quy định dùng safranin, với những lựa chọn thay thế được công nhận như fuchsin bazơ trong một số biến thể, chứ không phải xanh methylen. Cũng có một bất lợi thực tế: màu xanh khó phân biệt với màu tím hơn so với màu hồng, nhất là với người mới học và khi đèn kính hiển vi đã yếu. Trong thực hành học tập và với mọi kết quả quan trọng, hãy dùng thuốc nhuộm đối màu được chỉ định trong quy trình, thường là safranin, và xem nhuộm đối màu bằng xanh methylen là một biến thể minh họa thay vì một phương pháp tiêu chuẩn tương đương.
Câu hỏi liên quan về cách xanh methylen so sánh với các lựa chọn dùng một thuốc nhuộm khác được trình bày trong bài so sánh các phương pháp nhuộm đơn vi khuẩn.
Nhuộm E. coli bằng xanh methylen chứng minh điều gì, và không chứng minh điều gì
E. coli là trực khuẩn Gram âm, nhưng câu này kết hợp những dữ kiện từ nhiều phương pháp: hình thái từ quan sát hiển vi, phản ứng Gram từ nhuộm Gram, danh tính từ nuôi cấy kết hợp xét nghiệm sinh hóa hoặc phân tử. Tiêu bản phết nhuộm xanh methylen chỉ đóng góp phần đầu tiên. Nó xác lập rằng có tế bào hình que trong mẫu đã nhuộm và cho biết cách chúng sắp xếp. Nó không xác lập phản ứng Gram, vì không thực hiện phép thử tẩy màu. Nó không xác định loài, vì trực khuẩn thuộc nhiều loài trông giống nhau ở độ phân giải này.
Đây là chỗ báo cáo thường sai theo một cách có thể đoán trước. Người viết đưa kiến thức nền ("mẫu nuôi cấy này được cho là E. coli, và E. coli là Gram âm") vào dòng ghi nhận quan sát, khiến tiêu bản dường như xác nhận điều thực ra đã được giả định. Báo cáo rõ ràng hơn sẽ tách riêng các lớp thông tin: "Nhuộm đơn bằng xanh methylen: quan sát thấy trực khuẩn màu xanh; chỉ ghi nhận hình thái, không kiểm tra nhóm Gram." Sau đó, nếu nhuộm Gram đã được thực hiện đúng với các mẫu đối chứng: "Nhuộm Gram: trực khuẩn màu hồng, phù hợp với Gram âm." Việc xác định loài đến sau, từ quy trình định danh, không phải chỉ từ màu sắc.
Hướng dẫn diễn giải thực tế
Hãy dùng quy tắc quyết định này tại bàn thí nghiệm. Nếu tất cả tế bào có cùng một màu và quy trình dùng một thuốc nhuộm mà không có chất tẩy màu, bạn đã thực hiện nhuộm đơn. Hãy báo cáo hình dạng, kích thước ước tính và cách sắp xếp. Dừng ở đó. Nếu quy trình dùng tím tinh thể, iod, chất tẩy màu và thuốc nhuộm đối màu cùng các mẫu đối chứng Gram dương và Gram âm đã biết, bạn đã thực hiện nhuộm Gram. Hãy báo cáo màu sắc kèm hình thái: cầu khuẩn màu tím xếp thành chuỗi, trực khuẩn màu hồng, v.v.
Ba sai sót gây ra phần lớn sự nhầm lẫn. Thứ nhất, diễn giải quá mức rằng trực khuẩn màu xanh xác nhận E. coli. Thứ hai, ghi tiêu bản nhuộm xanh methylen dưới tiêu đề "nhuộm Gram" trong sổ ghi chép, khiến người đọc sau này hiểu sai. Thứ ba, tùy tiện thay thuốc nhuộm đối màu rồi so sánh màu sắc giữa các phòng thí nghiệm như thể tất cả dùng cùng một bảng màu. Mỗi sai sót đều có cùng cách khắc phục: nêu tên phương pháp thực sự đã thực hiện, và chỉ khẳng định những gì phương pháp đó kiểm tra.
Nhuộm đơn có giá trị chính vì phạm vi kết luận của nó hẹp. Phương pháp này nhanh, dễ thực hiện và đủ đáp ứng khi câu hỏi là về hình thái: có tế bào nào hiện diện không, và chúng có hình dạng gì. Khi câu hỏi là về phân loại, hãy thực hiện phép thử phân biệt. Tiêu bản màu xanh cho bạn biết tế bào trông như thế nào. Tiêu bản màu tím hoặc hồng cho bạn biết thành tế bào phản ứng ra sao. Không tiêu bản nào, nếu đứng riêng, cho bạn biết loài.