Đo các dạng oxy phản ứng trong thí nghiệm với xanh methylen

Hai phòng thí nghiệm thực hiện những gì mà mỗi bên đều gọi là thí nghiệm về tác dụng chống oxy hóa của xanh methylen. Một bên báo cáo rằng chất màu này làm giảm các dạng oxy phản ứng. Bên kia báo cáo rằng nó tạo ra chúng. Cả hai đều đưa ra các đường cong đáp ứng theo liều rõ ràng. Cả hai đều trung thực. Khác biệt không nằm ở gian lận hay thiếu năng lực. Vấn đề là hai nhóm đã đo những thứ khác nhau dưới điều kiện ánh sáng khác nhau, bằng các đầu dò trả lời những câu hỏi khác nhau, rồi mô tả cả hai kết quả bằng cùng một từ: ROS.

Xanh methylen là một phân tử khó đo chính xác vì nó tham gia vào chính quá trình hóa học mà lẽ ra nó dùng để quan sát. Trong bóng tối, nó chuyển electron giữa chất cho và chất nhận rồi trở về dạng ban đầu, sẵn sàng tiếp tục chu trình. Dưới ánh sáng, nó trở thành chất nhạy quang, đạt trạng thái kích thích triplet, từ đó có thể truyền năng lượng cho oxy để tạo oxy singlet hoặc chuyển electron để tạo các gốc tự do và hydro peroxit. Bất kỳ đầu dò nào đưa vào hệ này đều có thể bị oxy hóa, khử, tẩy màu hoặc bị chính chất màu che khuất về mặt quang học. Vì vậy, câu hỏi đầu tiên đối với bất kỳ kết quả đo ROS nào không bao giờ là con số bao nhiêu. Mà là phép thử thực sự phát hiện điều gì, và chất màu tác động thế nào đến phép thử.

Amplex Red: phép thử hydro peroxit có hiệu chuẩn

Sự kết hợp xanh methylen và Amplex Red là phương án có cơ sở vững chắc nhất trong các tài liệu nghiên cứu này, khi được thiết lập đúng. Cơ chế hóa học có tính đặc hiệu: peroxidase từ cải ngựa sử dụng hydro peroxit để oxy hóa cơ chất Amplex thành sản phẩm huỳnh quang resorufin, với tỷ lượng xấp xỉ một trên một. Peroxit từ mẫu chuyển thành tín hiệu huỳnh quang tại bộ phát hiện. Không dạng nào khác trong nhóm ROS thông thường trực tiếp thúc đẩy phản ứng đó.

Ưu điểm quyết định là hiệu chuẩn. Người thực hiện cẩn thận sẽ đo các mẫu chuẩn peroxit đã biết nồng độ trong cùng dung dịch đệm, với cùng nồng độ peroxidase và cơ chất, cùng thời gian ủ và cùng thiết lập quang học, rồi đối chiếu mẫu với đường chuẩn đó. Trong nghiên cứu trên ty thể não phân lập làm cơ sở cho phương pháp này, các tác giả đã làm đúng như vậy, bổ sung lượng peroxit đã biết vào cuối mỗi lần đo; các kết quả được báo cáo dưới dạng tốc độ tính bằng picomol mỗi phút trên mỗi miligam protein, thay vì đơn vị huỳnh quang tùy ý. Đó là điều biến một tín hiệu phát sáng thành một phép đo.

Ba chi tiết trong nghiên cứu đó đáng được làm theo. Thứ nhất, các tác giả xác minh tín hiệu bằng catalase, enzyme phân hủy peroxit. Sự gia tăng huỳnh quang do xanh methylen gây ra dừng lại khi thêm catalase, xác nhận tín hiệu là do peroxit chứ không phải giả ảnh quang học. Thứ hai, họ kiểm tra trực tiếp tác động của chiếu sáng bằng cách đóng ngắt chùm tia kích thích để mẫu chỉ nhận một phần tám liều ánh sáng thông thường, và tín hiệu chỉ giảm chín phần trăm. Hơn chín mươi phần trăm lượng peroxit họ báo cáo không phụ thuộc vào ánh sáng dùng để đo. Thứ ba, họ đo riêng sự loại bỏ peroxit bằng điện cực và thấy rằng chất màu vừa làm tăng sản xuất vừa làm chậm loại bỏ. Một đầu dò chỉ báo cáo huỳnh quang ròng sẽ gộp lẫn hai tác động đó.

Phép thử này vẫn có những cơ chế gây sai lệch, và xanh methylen có thể gây ra một số cơ chế trong đó. Chất màu hấp thụ trên một dải rộng trong cùng vùng đỏ mà resorufin phát xạ, nên ở nồng độ chất màu cao, mẫu có thể tự che khuất tín hiệu của mình thông qua hiệu ứng lọc nội. Vì vậy, các mẫu chuẩn cần có cùng nồng độ chất màu với mẫu thử. Amplex Red cũng có thể tự bị quang oxy hóa, và sản phẩm resorufin của nó có thể tham gia chu trình oxy hóa–khử quang hóa tạo ra superoxit và peroxit; điều này đặc biệt quan trọng khi thí nghiệm cũng chiếu sáng một chất nhạy quang. Cách khắc phục thực tế là chiếu xạ các mẫu xanh methylen trước, rồi lấy các phần mẫu để thử với thuốc thử Amplex trong bóng tối, thay vì chiếu sáng đồng thời chất màu và đầu dò. Cuối cùng, superoxide dismutase không chỉ đơn thuần làm giảm tín hiệu Amplex: việc chuyển superoxit thành peroxit có thể làm tăng tín hiệu. Một đối chứng SOD làm tăng huỳnh quang không phải là đối chứng thất bại. Nó đã xác định superoxit là dạng phản ứng ở bước trước.

DCFDA: chỉ thị oxy hóa không đặc hiệu

Sự kết hợp xanh methylen và DCFDA là nguồn gốc của phần lớn sự nhầm lẫn. DCFH-DA là tiền chất dùng để đưa đầu dò vào tế bào. Các esterase bên trong tế bào loại bỏ các nhóm acetat của nó, để lại DCFH không phát huỳnh quang; quá trình oxy hóa DCFH tạo ra DCF phát huỳnh quang. Có rất nhiều tác nhân oxy hóa nó: gốc hydroxyl, các chất trung gian của peroxidase và heme, nitơ dioxit, axit hypoclorơ và các gốc có nguồn gốc từ peroxynitrit. Hydro peroxit đơn độc không trực tiếp oxy hóa nó với tốc độ đủ hữu ích; huỳnh quang phụ thuộc peroxit thường cần sắt, protein heme hoặc phản ứng hóa học của peroxidase tham gia.

Phân tích phê bình mà mọi phần phương pháp đều nên trích dẫn là công trình của Kalyanaraman và cộng sự về DCFH dùng làm đầu dò, được tóm tắt trong nghiên cứu trên ty thể não đã loại bỏ DCFDA vì lý do này. Phân tích đó cho thấy chất màu phản ứng chậm, có tỷ lượng chưa được xác định, không có hiệu chuẩn hợp lệ và phản ứng với cả các hợp chất không phải ROS. Đầu dò còn khuếch đại chính thứ nó đo: quá trình oxy hóa DCFH bằng cách lấy đi một electron tạo ra gốc DCF, gốc này phản ứng với oxy để tạo superoxit, rồi superoxit phản ứng tự oxy hóa–khử để tạo thêm peroxit. Phép đo phần nào tự tạo ra quá trình hóa học mà nó báo cáo.

Những điều này không khiến DCFDA trở nên vô dụng. Chúng khiến nó là một phép sàng lọc, không phải phép định danh. Huỳnh quang DCF tăng có nghĩa là quá trình oxy hóa đầu dò phụ thuộc chất oxy hóa đã tăng. Điều đó không có nghĩa là peroxit tăng, và chắc chắn không có nghĩa là tổng ROS tăng — một đại lượng mà không đầu dò đơn lẻ nào đo được. Các nghiên cứu trước đây về xanh methylen dựa vào quá trình oxy hóa DCF ở nồng độ trên một micromol đã báo cáo tác dụng thúc đẩy oxy hóa, trong khi các hệ khác cùng thời kỳ báo cáo sự bảo vệ trước tình trạng chết tế bào do peroxit gây ra. Cả hai quan sát đều có thể đúng với cùng một chất màu trong các bối cảnh oxy hóa–khử khác nhau, và riêng kết quả DCF không thể cho biết chất oxy hóa nào tạo ra tín hiệu. Điểm quan trọng của nghiên cứu trước đây trên ty thể não là nghiên cứu đã thay thế phép sàng lọc này bằng phép đo peroxit có hiệu chuẩn và xác định trực tiếp mức gia tăng: ngay cả ở nồng độ một trăm nanomol, chất màu cũng làm tăng lượng peroxit giải phóng lên nhiều lần với mọi cơ chất và trạng thái hô hấp được thử nghiệm.

DCFDA còn có một bẫy khác đặc thù với xanh methylen. Chất màu này có màu đậm và hoạt tính oxy hóa–khử, nên có thể làm mất huỳnh quang, dập tắt phát xạ hoặc oxy hóa thành phần của hệ đầu dò độc lập với ROS trong tế bào. Đối chứng không tế bào, chỉ có chất màu và đầu dò, không phải phần bổ sung tùy chọn. Đó là thí nghiệm cho biết liệu chất màu có tương tác với đầu dò hay không.

Bẫy spin và mức tiêu thụ oxy: định danh và thông lượng

Trong khi các đầu dò huỳnh quang báo cáo rằng có chất có thể bị oxy hóa xuất hiện, cộng hưởng spin electron kết hợp với chất bẫy spin cho biết gần hơn chất đó là gì. Nghiên cứu kinh điển về quang hóa của xanh methylen đã dùng ESR để phát hiện gốc ascorbat từ chất màu, ascorbat và ánh sáng, sau đó chứng minh sự hình thành peroxit trong các thí nghiệm đo mức tiêu thụ oxy và sự hình thành gốc hydroxyl được sắt xúc tác trong các thí nghiệm bẫy spin. Mỗi kỹ thuật trả lời câu hỏi mà những kỹ thuật khác không thể: ESR xác định loại gốc, mức tiêu thụ oxy cho biết thông lượng phản ứng độc lập với mọi đầu dò huỳnh quang, và sự kết hợp này cho thấy cả con đường oxy singlet lẫn con đường gốc tự do cùng hoạt động trong một hệ được chiếu sáng.

Kết quả năm 1984 đó đến nay vẫn như một lời cảnh báo. Khi có chiếu sáng và chất khử, chất màu tạo ra peroxit; khi có sắt, hệ tạo ra gốc hydroxyl, dạng phản ứng mạnh nhất trong nhóm. Các tác giả liên hệ điều này với ascorbat trong mắt và đặt vấn đề về việc sử dụng tùy tiện trong nhãn khoa. Người đọc ngày nay cần lưu ý các điều kiện: ánh sáng cộng chất khử cộng sắt. Loại bỏ bất kỳ yếu tố nào trong số đó thì con đường phản ứng sẽ suy yếu hoặc biến mất.

Điện cực oxy có giá trị theo một cách khác. Điện cực kiểu Clark đo mức tiêu thụ oxy ròng, qua đó xác nhận rằng quá trình oxy hóa–khử do chất màu thúc đẩy đang tiêu thụ oxy phân tử, đồng thời cung cấp dữ liệu động học mà không giả ảnh huỳnh quang nào có thể tạo ra. Nó không xác định sản phẩm. Sự tạo thành peroxit, superoxit, nước và sự phân rã oxy singlet đều tiêu thụ oxy. Thông lượng không kèm định danh cũng thiếu hoàn chỉnh như định danh không kèm thông lượng; đó là lý do các công trình có cơ sở vững chắc kết hợp điện cực với phép thử peroxit có hiệu chuẩn hoặc chất bẫy.

Vì sao các kết quả chống oxy hóa mâu thuẫn

Đặt ba loại kết quả đo cạnh nhau, những mâu thuẫn có vẻ tồn tại trong tài liệu về xanh methylen sẽ được giải thích bằng khác biệt về phương pháp cùng ba thực tế sinh học.

Thứ nhất, chất màu vừa là chất chuyển electron vừa là nguồn peroxit. Bằng cách chuyển hướng electron khỏi các vị trí trong chuỗi hô hấp nơi oxy có thể chuyển thành superoxit, nó có thể làm giảm một dạng ROS, trong khi dạng khử của nó trực tiếp khử oxy thành peroxit, làm tăng một dạng khác. Vì vậy, phòng thí nghiệm nghiên cứu hóa học oxy hóa–khử của ty thể và vai trò tạo đường đi vòng của xanh methylen nên dự kiến những kết quả phụ thuộc vào đầu dò: tín hiệu nhạy với superoxit giảm trong khi tín hiệu peroxit tăng ngay trong cùng một cuvet.

Thứ hai, peroxit ở liều thấp là tín hiệu, không chỉ là tác nhân gây tổn thương. Nghiên cứu trên ty thể não chuột tiếp nối công trình trước đó ghi nhận sự tạo thành peroxit từ nồng độ chất màu chỉ năm mươi nanomol mà không có tổn thương DNA ty thể ở mức điều trị, cùng với sự bảo vệ trước tổn thương do rotenone gây ra sau khi xử lý trước. Chỉ ở nồng độ một trăm micromol, cao hơn nhiều so với khoảng điều trị, chất màu mới gây tổn thương một số đoạn DNA được chọn; còn ánh sáng đỏ kết hợp với chất màu ở nồng độ hai mươi micromol tạo ra oxy singlet gây tổn thương tất cả các đoạn được thử nghiệm. Cơ chế được đề xuất là hormesis: sự tạo thành peroxit ở mức nhẹ kích hoạt các cơ chế bảo vệ chống oxy hóa liên quan đến Nrf2 và sự hình thành ty thể mới, nên kết quả thúc đẩy oxy hóa trong ngắn hạn xuất hiện trước kết quả chống oxy hóa trong dài hạn. Phép thử được đọc sau một giờ và phép thử được đọc sau một ngày có thể cho kết quả khác nhau vì trạng thái sinh học đã thay đổi trong khoảng thời gian đó.

Thứ ba, ánh sáng quyết định ngay cả phân tử nào hiện diện. Chiếu sáng làm mất các nhóm methyl của chất màu, tạo thành Azure B và các sản phẩm liên quan; đèn kính hiển vi chiếu trên đĩa cũng đủ để gây nhạy quang. Thí nghiệm trong bóng tối và thí nghiệm có chiếu sáng là những thí nghiệm khác nhau, và phần đối chứng về chiếu sáng và xử lý chất màu trong bất kỳ quy trình nào cũng cần xem chúng như vậy.

Bộ đối chứng tối thiểu và cách đọc mọi nhận định

Bảng so sánh dưới đây là tài liệu tham khảo gốc của bài viết này. Trước khi chấp nhận bất kỳ kết quả ROS nào liên quan đến xanh methylen, hãy kiểm tra xem các tác giả đã thực hiện hàng nào và bỏ qua hàng nào.

Từ đó có thể rút ra một quy tắc đọc thực tế. Amplex kết hợp với peroxidase, được hiệu chuẩn và kiểm tra bằng catalase, là bằng chứng về peroxit. DCFDA là bằng chứng về quá trình oxy hóa đầu dò không đặc hiệu, không hơn. Bẫy spin có đối chứng bằng chất bắt giữ gốc tự do là bằng chứng về loại gốc. Mức tiêu thụ oxy là bằng chứng về thông lượng. Một câu khẳng định vượt quá những gì phép thử có thể chứng minh, dù được viết tự tin đến đâu, cũng chỉ nói về đầu dò chứ không phải chất màu. Các thảo luận liên quan về sự phụ thuộc vào liều và khoảng hormesis, dòng electron trong ty thể, nhiễu phép thử trong mẫu nhuộm và giả ảnh do chiếu sáng trong kính hiển vi mở rộng từng điểm này; mỗi điểm vẫn có giá trị khi tham chiếu giữ chỗ của nó được thay thế.