Metilen ko‘ki hujayralarga qanday kiradi: qaytarilish, qayta oksidlanish, yutilish

Idishdagi endoteliy hujayralarining metilen ko‘kini yutishini kuzatsangiz, eng ravshan ko‘ringan talqin ayni paytda noto‘g‘ri bo‘lib chiqadi. Muhit ko‘k rangini yo‘qotadi, hujayralarda esa ko‘k donachalar paydo bo‘ladi; demak, bo‘yoq membranadan ko‘k molekula holida o‘tgan bo‘lishi kerak. Tajribalar esa buning aksini ko‘rsatadi. Ko‘k shakl deyarli o‘tmaydi. O‘tadigan shakl rangsiz bo‘lib, ichkarida ko‘rinadigan ko‘k rang kirishdan keyin, hujayraning o‘zida hosil bo‘ladi.

Bu teskari manzara muhim, chunki u bo‘yalish nimani ko‘rsatishi va nimani ko‘rsata olmasligini belgilaydi. Ko‘k donachalar qayta oksidlangan va organellalarda ushlanib qolgan oksidlangan bo‘yoqni ko‘rsatadi. Ular hujayradagi jami bo‘yoq miqdorini ham, qaytarilgan shakl zaxirasini ham ko‘rsatmaydi va biologik ta’sirni o‘lchamaydi. Sababini tushunish uchun uch bosqichni kuzating: sirtda qaytarilish, qaytarilgan shaklning diffuziyasi, ichkarida qayta oksidlanish va ushlanib qolish.

Ikki shakl turli molekulalardek tutadi

Oksidlangan metilen ko‘ki yassi, musbat zaryadlangan halqalar tizimidir. U suvda eriydi, taxminan 600 dan 700 nanometrgacha bo‘lgan diapazonda yorug‘likni kuchli yutadi va ko‘k ko‘rinadi. Asosiy jihat — zaryad. Zaryadlangan, suvga moyil molekula lipid membranadan oson o‘tmaydi, shu sababli adabiyotlarda ehtiyotkorlik bilan «membranadan nisbatan o‘tmaydigan» deyiladi, mutlaqo o‘tmaydigan emas.

Leykometilen ko‘ki deb ataladigan qaytarilgan metilen ko‘ki rangsiz, zaryadsiz va yog‘da eruvchandir. Zaryad olib tashlansa, membrana devor bo‘lishdan to‘xtaydi. Qaytarilgan molekula membranadan oson diffuziyalanadi va oksidlovchi xususiyati kuchliroq bo‘lgan ichki bo‘limga kirgach, yana elektronlarini yo‘qotib, ko‘k, zaryadlangan va ushlanib qoladigan shaklga qaytishi mumkin. Shuning uchun bo‘yoqning oksidlanish-qaytarilish kimyosi uning tashilish mexanizmi hamdir. Elektronlar sonini o‘zgartirsangiz, membranadan o‘tuvchanlik ham o‘zgaradi.

Birinchi bosqich uchun elektronlar hujayraning o‘zidan keladi. Sutemizuvchilar hujayralari plazmatik membrana orqali elektron tashiydi: qaytaruvchi ekvivalentlarni hujayra ichidagi donorlardan sirtdagi akseptorlarga uzatadi. Plazmatik membrana orqali kechadigan bu faollik hujayraning odatiy funksiyasi bo‘lib, aksariyat hujayra turlarida uchraydi. Tiazin bo‘yoqlariga ta’sir qiladigan endoteliy sirtidagi reduktaza bir muhim jihatdan boshqa reduktazalarga o‘xshaydi: keyingi bosqichlarni to‘xtatadigan dozalardagi sianid va azid mavjudligida ham ishlashda davom etadi. Butun tushuntirishning asosiy nuqtasi — shu bosqichlarning bir-biridan ajratilishidir.

Avval taqsimlanish o‘rganilgan va u yutilishni deyarli tushuntirib bergan

1929 yilda Rockefeller institutidagi Marian Irwin oddiyroq savol qo‘ydi. Ehtimol, bo‘yoqning kirishi shunchaki suv va hujayraning yog‘simon qatlamlari o‘rtasida taqsimlanishdir, laboratoriyada esa bu yog‘simon qatlamlar o‘rnini xloroform qatlami bosishi mumkin. Uning spektrofotometrik kirib borish tadqiqotlarida bo‘yoqning suvli eritmalari xloroform bilan chayqatilib, organik fazaga o‘tgan modda tirik suvo‘t hujayralariga kirgan modda bilan taqqoslangan.

Bu ishning ikki natijasi hanuz e’tiborga loyiq. Birinchidan, savdoda mavjud metilen ko‘ki eritmalarida hozir azure B deb ataladigan trimetil tionin bo‘lgan va bu aralashma metilen ko‘kining o‘zidan tezroq kirgan. Bu, ayniqsa, lipidda eruvchan erkin asos shakli ustun bo‘ladigan ishqoriy pH sharoitida kuzatilgan. Metilen ko‘kining kirishi deb ko‘ringan holatlarning bir qismi aslida azure B ning tanlab kirishi bo‘lgan. Ikkinchidan, pH ionlanish holatini belgilash orqali natijani belgilagan, shikastlangan hujayralar esa butun hujayralarga qaraganda ancha ko‘p bo‘yoqni o‘tkazgan. Sun’iy tizim va tirik hujayraning har biri nimani yutishini taqsimlanish koeffitsiyentlari va zaryad holati boshqargan; ikkalasi o‘rtasidagi o‘xshashlik hujayra chegarasida suvsiz qatlamlar borligi haqidagi fikrni qo‘llab-quvvatlagan.

Model lipidlar va ionlanish borasida o‘z davridan ilgarilab ketgan edi. Ammo u o‘z shaklida taqsimlanadigan bo‘yoq bilan sirtda kimyoviy o‘zgarib, boshqa shaklda membranadan o‘tadigan va ichkarida yana dastlabki shakliga qaytadigan bo‘yoqni farqlay olmagan. Buni farqlash uchun boshqa tajriba kerak edi va u yetmish yil o‘tib, o‘pka endoteliyida o‘tkazildi.

Tashqarida qaytarilish, ichkarida ushlanib qolish

Merker va hamkasblari kulturada o‘stirilgan qoramol o‘pka arteriyasi endoteliy hujayralari bilan ishlab, uch bosqichli ketma-ketlikni taklif qilishdi: oksidlangan bo‘yoq hujayra sirtida rangsiz lipofil shakliga qaytariladi, qaytarilgan shakl ichkariga diffuziyalanadi, hujayra ichidagi qayta oksidlanish esa membranadan o‘tmaydigan oksidlangan shaklni qayta hosil qiladi va u to‘planadi. Keyin ularning endoteliyda tiazin yutilishi bo‘yicha tadqiqoti ushbu ketma-ketlikni muayyan nuqtalarda uzishga urinish orqali tekshirdi.

Birinchi vosita hujayraga kira olmaydigan elektron akseptori — ferritsianid edi. Sirt fermentlari hujayra tashqarisida ko‘k bo‘yoqni rangsiz shakliga qaytarganda, ferritsianid bu elektronlarni qaytarib olishi va bo‘yoq membranadan o‘tishga ulgurmasidan muhitda yana ko‘k bo‘yoqni hosil qilishi mumkin. Ferritsianid ortiqcha miqdorda mavjud bo‘lganida (10 mikromolyar bo‘yoqqa nisbatan 50 dan 500 mikromolyargacha ferritsianid), bo‘yoq yutilishi deyarli to‘xtagan. Faqat ferritsianid sarflanib tugagach, yutilish odatiy tezlikda davom etgan. Kinetika ham shu manzarani boshqa yo‘l bilan ko‘rsatgan. Ferritsianid taxminan doimiy tezlikda yo‘qolgan, bu qayta-qayta ishlatiladigan mediatorni ta’minlaydigan barqaror sirt qaytarilish oqimiga mos kelgan. Hujayra tashqarisidagi bo‘yoq esa uning zaxirasi kamaygani sari eksponensial tarzda yo‘qolgan. Doimiy oqim va kamayib borayotgan zaxira ferritsianid signali eritmadan chiqib ketayotgan bo‘yoq molekulalarini emas, uzluksiz qaytarilishni aks ettirishini anglatadi.

Ikkinchi vosita membranadan o‘tish bosqichini butunlay chiqarib tashlagan. Guruh tiazinlarning yaqin turdoshi bo‘lgan toluidin ko‘ki O ni har ikkala oksidlanish holatida ham hujayraga kira olmaydigan darajada katta poliakrilamid zanjiriga biriktirgan. Hujayralar biriktirilgan bo‘yoqni baribir qaytargan. Demak, qaytarilish uchun hujayra ichiga kirish shart emas. Bu jarayonni amalga oshiradigan tizim sirtda joylashgan yoki u bilan elektr jihatdan bog‘langan.

Keyin maqola nomiga asos bo‘lgan ajratish kuzatilgan. 2 millimolyar sianid va azid bo‘yoq to‘planishini kuchli bostirgan. Mikroskop ostida odatda yadroni o‘rab turadigan to‘q ko‘k va binafsha kiritmalar deyarli yo‘qolgan. Biroq ingibitorlarning hech biri hujayra tashqarisidagi qaytarilishni sekinlashtirmagan: ferritsianid sikli susaymasdan davom etgan, membranadan o‘tmaydigan polimerga biriktirilgan bo‘yoq esa hamon qaytarilgan. To‘siq keyingi bosqichda bo‘lgan. Sianid va azid sirtdagi qaytarilishni emas, hujayra ichidagi qayta oksidlanish va ajratib ushlab qolishni to‘xtatgan. Hujayralarning yashovchanligini tekshirish natijalari bu talqinni qo‘llab-quvvatlagan: ushbu ishlovlar davomida hujayralar sitozoldagi marker ferment — laktatdegidrogenazani saqlab qolgan. Demak, yutilishning yo‘qolishi shunchaki zaharlanish yoki membrananing yorilishi oqibati bo‘lmagan.

Maqoladagi bir ehtiyotkorlik eslatmasi hanuz o‘rinli. Ko‘k kiritmalar yadro ichida emas, uning atrofida joylashgan bo‘lib, bu hujayra ichidagi organellalarda oksidlanishga mos kelgan. Ammo tadqiqot qaysi organellalar ekanini aniqlamagan. Boshqa hujayra turlaridagi o‘xshash ko‘rinishlar yetarli dalilsiz lizosomalarga tegishli deb atalgan edi. Ushlanib qolishni tasdiqlangan, uning joylashuvini esa taxminiy deb qabul qiling. Elektronlar keyin qayerga borishini kuzatayotgan o‘quvchilar mitoxondriyalarda elektron tashilishi va oksidlanish-qaytarilish jarayonlari hamda kirish yo‘liga qarab so‘rilish va taqsimlanish haqidagi kengroq manzarani o‘rganishda davom etishlari mumkin.

Bo‘yalish ekspozitsiya emas

Uchinchi tadqiqot bu yutilish mexanizmi biologik ko‘rsatkich bilan solishtirilganda nima yuz berishini ko‘rsatadi. Scott va hamkasblari halqasimon torus shaklidagi shakar — metil beta siklodekstrin metilen ko‘kini bevosita bog‘lashini aniqlashgan. Kiritish kompleksi uchun assotsiatsiya konstantasi taxminan 310 molyar⁻¹, bo‘yoq dimerlanishi uchun esa taxminan 5846 molyar⁻¹ bo‘lgan. L929 fibroblastlarida bu bog‘lanish ham hujayra bo‘yalishini, ham glyukoza yutilishining rag‘batlanishini to‘sib qo‘ygan: siklodekstrin bilan oldindan inkubatsiya qilish ko‘k bo‘yalishning oldini olgan, uni keyin qo‘shish esa rangning yo‘qolishini tezlashtirgan. Optik ko‘k signal hujayralardan yo‘qolgani sari faollashgan glyukoza tashilishi ham unga juda yaqin parallel tarzda susaygan.

Mualliflar bu korrelatsiyani uzoq davom etadigan oksidlovchi stress mexanizmidan ko‘ra, bo‘yoq bilan glyukoza tashuvchisini faollashtirish yo‘lidagi oqsil o‘rtasidagi bevosita o‘zaro ta’sir foydasiga talqin qilishgan. Bu xulosa asosli, ammo chegaralangan. Tajriba oqsilni aniqlamaydi, tashuvchining o‘ziga bog‘lanishni ko‘rsatmaydi, rangning yo‘qolishi bilan ta’sirning yo‘qolishi o‘rtasidagi korrelatsiya esa oksidlanish-qaytarilish vositasida kechadigan barcha yo‘llarni istisno qila olmaydi.

Asosiy saboq o‘lchashga taalluqli. Optik bo‘yalish ko‘rinadigan, oksidlangan, hujayra bilan bog‘liq bo‘yoqni aks ettiradi. U rangsiz qaytarilgan shakl zaxirasini butunlay hisobga olmaydi. Shu sababli xira hujayrada ham bo‘yoq ekvivalentlari saqlanib qolishi mumkin; kuchli bo‘yalgan hujayra esa to‘qimadagi jami ekspozitsiya yoki ta’sir kattaligini emas, ushlanib qolgan oksidlangan bo‘yoqni ko‘rsatadi. Xuddi shu ehtiyotkorlik kengroq miqyosda ham zarur: turli hujayra turlaridagi bo‘yalishni taqqoslash yoki to‘qima kesimining to‘q rangini yuqoriroq ekspozitsiya isboti deb qabul qilish idishdagi dastlabki xatoni takrorlaydi. Yutilish — qaytarilish, diffuziya va qayta oksidlanish sikli. Ko‘k shaklning istalgan bir lahzadagi tasviri esa bu siklning faqat bir qismini ko‘rsatadi. Laboratoriyada bo‘yash va ishlash uchun hamda doza va ekspozitsiya haqidagi da’volarni talqin qilish uchun amaliy xulosalar bevosita shundan kelib chiqadi.