میتھیلین بلیو خلیوں میں کیسے داخل ہوتا ہے: اختزال، دوبارہ تکسید، اور جھلی میں تقسیم

اینڈوتھیلیل خلیوں کی ایک ڈش کو میتھیلین بلیو جذب کرتے دیکھیں تو جو مطلب بظاہر واضح لگتا ہے، وہی غلط بھی ہے۔ میڈیم کا نیلا رنگ ختم ہوتا ہے اور خلیوں میں نیلے دانے نمودار ہوتے ہیں، لہٰذا لگتا ہے کہ رنگ دار مادہ نیلے سالمے کی صورت میں جھلی سے گزر گیا ہوگا۔ تجربات کچھ اور بتاتے ہیں۔ نیلی صورت بمشکل پار ہوتی ہے۔ جو صورت پار ہوتی ہے وہ بے رنگ ہے، اور اندر نظر آنے والا نیلا رنگ پہنچنے کے بعد اندر ہی بنتا ہے۔

یہ الٹی ترتیب اہم ہے، کیونکہ اسی سے طے ہوتا ہے کہ رنگ آمیزی آپ کو کیا بتا سکتی ہے اور کیا نہیں۔ نیلے دانے اس تکسید شدہ رنگ دار مادے کی نشاندہی کرتے ہیں جو دوبارہ تکسید کے بعد عضیوں میں محصور ہو گیا۔ یہ خلیے میں موجود رنگ دار مادے کی کل مقدار نہیں بتاتے، اختزال شدہ ذخیرے کی نشاندہی نہیں کرتے، اور حیاتیاتی اثر کو نہیں ناپتے۔ اس کی وجہ سمجھنے کے لیے تین مراحل دیکھیں: سطح پر اختزال، اختزال شدہ صورت کا انتشار، اور اندر دوبارہ تکسید اور محصور ہونا۔

دونوں صورتیں مختلف سالموں کی طرح برتاؤ کرتی ہیں

تکسید شدہ میتھیلین بلیو ایک چپٹا، مثبت بار رکھنے والا حلقوی نظام ہے۔ یہ پانی میں حل ہوتا ہے، تقریباً 600 سے 700 nanometers کے درمیان روشنی کو شدت سے جذب کرتا ہے، اور نیلا دکھائی دیتا ہے۔ اصل اہمیت بار کی ہے۔ بار رکھنے والا، پانی سے رغبت رکھنے والا سالمہ لپڈ جھلی سے آسانی سے نہیں گزرتا، اس لیے علمی لٹریچر میں محتاط تعبیر یہ ہے کہ یہ جھلی کے پار نسبتاً کم قابلِ نفوذ ہے، نہ کہ بالکل ناقابلِ نفوذ۔

اختزال شدہ میتھیلین بلیو، جسے لیوکومیتھیلین بلیو کہتے ہیں، بے رنگ، بے بار، اور چکنائی میں حل پذیر ہوتا ہے۔ بار ہٹا دیں تو جھلی دیوار نہیں رہتی۔ اختزال شدہ سالمہ انتشار کے ذریعے آسانی سے پار ہو جاتا ہے، اور زیادہ تکسیدی ماحول والے حصے میں پہنچ کر دوبارہ الیکٹران کھو سکتا ہے اور نیلی، بار رکھنے والی، محصور صورت میں واپس آ سکتا ہے۔ لہٰذا رنگ دار مادے کی ریڈوکس کیمیا ہی اس کی منتقلی کا طریقۂ کار بھی ہے۔ الیکٹرانوں کی تعداد بدلیں تو نفوذ پذیری بھی بدل جاتی ہے۔

پہلے مرحلے کے الیکٹران خود خلیے سے آتے ہیں۔ ممالیہ کے خلیے پلازما جھلی کے آرپار الیکٹران منتقل کرتے ہیں، اور خلیے کے اندر موجود عطیہ دہندگان سے اختزالی مساویات کو باہر سطح پر موجود قبول کنندگان تک پہنچاتے ہیں۔ پلازما جھلی کے آرپار ہونے والی یہ سرگرمی خلیے کا ایک معمول کا فعل ہے، جو زیادہ تر اقسام کے خلیوں میں پایا جاتا ہے۔ اینڈوتھیلیل سطح کا ریڈکٹیز، جو تھیازین رنگ دار مادوں پر عمل کرتا ہے، ایک اہم پہلو میں دوسرے ریڈکٹیز جیسا برتاؤ کرتا ہے: یہ سائنائڈ اور ایزائڈ کی ایسی مقداروں کی موجودگی میں بھی کام کرتا رہتا ہے جو بعد کے مراحل کو روک دیتی ہیں۔ یہی تفریق پوری کہانی کا مرکزی نکتہ ہے۔

تقسیم کا تصور پہلے آیا، اور اس نے جذب کی تقریباً وضاحت کر دی

1929 میں، راکفیلر انسٹی ٹیوٹ کی میریئن ارون نے ایک نسبتاً سادہ سوال اٹھایا۔ شاید رنگ دار مادے کا داخلہ محض پانی اور خلیے کی چکنائی والی تہوں کے درمیان تقسیم کا نتیجہ ہو، اور تجربہ گاہ میں کلوروفارم کی ایک تہہ ان چکنائی والی تہوں کی نمائندگی کر سکے۔ ان کے اسپیکٹروفوٹومیٹری پر مبنی نفوذ کے مطالعات میں رنگ دار مادوں کے آبی محلولوں کو کلوروفارم کے ساتھ ہلایا گیا، اور نامیاتی فیز میں منتقل ہونے والے مادے کا موازنہ اس مادے سے کیا گیا جو زندہ الجی کے خلیوں میں داخل ہوا۔

اس کام کے دو نتائج آج بھی توجہ کے مستحق ہیں۔ پہلا یہ کہ تجارتی میتھیلین بلیو محلولوں میں ٹرائی میتھیل تھیونین، جسے اب azure B کہا جاتا ہے، موجود تھا۔ یہ ملاوٹ خود میتھیلین بلیو سے زیادہ تیزی سے اندر داخل ہوئی، خاص طور پر قلوی pH پر، جہاں لپڈ میں حل پذیر آزاد بیس کی صورت غالب ہوتی ہے۔ بظاہر میتھیلین بلیو کا کچھ داخلہ دراصل azure B کا ترجیحی داخلہ تھا۔ دوسرا یہ کہ pH نے آئنائزیشن کی حالت متعین کر کے نتیجہ طے کیا، اور متاثرہ خلیوں میں سالم خلیوں کے مقابلے میں کہیں زیادہ رنگ دار مادہ داخل ہوا۔ تقسیم کے عددی عوامل اور بار کی حالت نے طے کیا کہ مصنوعی نظام اور زندہ خلیہ ہر ایک کیا جذب کرتا ہے۔ دونوں کے درمیان مماثلت نے اس خیال کی تائید کی کہ خلیے کی حد میں غیر آبی تہیں موجود ہیں۔

لپڈز اور آئنائزیشن کے بارے میں یہ ماڈل پیش بین تھا، لیکن یہ ایک ایسے رنگ دار مادے میں فرق نہیں کر سکتا تھا جو اپنی اصل صورت میں تقسیم ہوتا ہے، اور ایسے مادے میں جو سطح پر کیمیائی طور پر بدلتا ہے، بدلی ہوئی صورت میں پار ہوتا ہے، اور اندر پھر اصل صورت میں واپس آ جاتا ہے۔ اس فرق کے لیے ایک مختلف تجربہ درکار تھا، جو ستر سال بعد پھیپھڑوں کے اینڈوتھیلیم میں سامنے آیا۔

باہر اختزال، اندر محصور ہونا

مرکر اور ان کے ساتھیوں نے کلچر میں اگائے گئے گائے کی پھیپھڑوں کی شریان کے اینڈوتھیلیل خلیوں پر کام کیا اور تین مرحلوں کی ترتیب تجویز کی: تکسید شدہ رنگ دار مادہ خلیے کی سطح پر اختزال ہو کر اپنی بے رنگ، چکنائی دوست صورت اختیار کرتا ہے، اختزال شدہ صورت انتشار کے ذریعے اندر جاتی ہے، اور خلیے کے اندر دوبارہ تکسید جھلی کے لیے ناقابلِ نفوذ تکسید شدہ صورت کو پھر پیدا کرتی ہے، جو جمع ہونے لگتی ہے۔ پھر ان کے اینڈوتھیلیل خلیوں میں تھیازین کے جذب کے مطالعے نے مخصوص مقامات پر اس ترتیب کو روکنے کی کوشش کر کے اسے جانچا۔

پہلا ذریعہ فیری سائنائڈ تھا، جو الیکٹران قبول کرتا ہے لیکن خلیے میں داخل نہیں ہو سکتا۔ جب سطحی خامرے خلیے کے باہر نیلے رنگ دار مادے کا اختزال کر کے اسے بے رنگ صورت میں بدلتے ہیں، تو فیری سائنائڈ وہ الیکٹران واپس لے سکتا ہے اور مادے کے جھلی پار کرنے سے پہلے ہی میڈیم میں نیلا رنگ دوبارہ پیدا کر سکتا ہے۔ جب تک فیری سائنائڈ اضافی مقدار میں موجود رہا، یعنی 10 micromolar رنگ دار مادے کے مقابلے میں 50 سے 500 micromolar فیری سائنائڈ، رنگ دار مادے کا جذب تقریباً رک گیا۔ فیری سائنائڈ کے استعمال ہو جانے کے بعد ہی جذب اپنی معمول کی رفتار سے دوبارہ شروع ہوا۔ حرکیاتی نتائج نے یہی بات ایک دوسرے انداز سے بتائی۔ فیری سائنائڈ تقریباً مستقل شرح سے ختم ہوا، جو اس بات سے مطابقت رکھتا تھا کہ سطح پر اختزال کا ایک مسلسل بہاؤ ایسے واسطے کو الیکٹران دے رہا تھا جو بار بار استعمال ہو سکتا ہے۔ اس کے برعکس، خلیے سے باہر رنگ دار مادے کا ذخیرہ گھٹنے کے ساتھ اس کی مقدار اسی نمائی انداز میں کم ہوئی۔ مستقل بہاؤ اور گھٹتے ہوئے ذخیرے کا امتزاج بتاتا ہے کہ فیری سائنائڈ کا سگنل مسلسل اختزال کی نشاندہی کرتا ہے، نہ کہ رنگ دار سالموں کے محلول سے نکلنے کی۔

دوسرے ذریعے نے جھلی پار کرنے کے مرحلے کو مکمل طور پر ہٹا دیا۔ گروہ نے تھیازین کے ایک قریبی رشتہ دار، ٹولوئیڈین بلیو O، کو پولی ایکریلامائڈ کی ایک بڑی زنجیر سے جوڑ دیا، جو تکسید کی کسی بھی حالت میں خلیے میں داخل ہونے کے لیے بہت بڑی تھی۔ خلیوں نے پھر بھی اس بندھے ہوئے رنگ دار مادے کا اختزال کیا۔ لہٰذا اختزال کے لیے خلیے کے اندر رسائی ضروری نہیں۔ اس کا نظام سطح پر موجود ہے یا برقی طور پر اس سے منسلک ہے۔

پھر وہ تفریق سامنے آئی جس سے مقالے کا عنوان اخذ ہوا۔ 2 millimolar پر سائنائڈ اور ایزائڈ نے رنگ دار مادے کے جمع ہونے کو بہت حد تک دبا دیا، اور خردبین کے نیچے وہ گہرے نیلے اور جامنی ذرات تقریباً غائب ہو گئے جو عموماً مرکزے کے گرد حلقہ بناتے ہیں۔ تاہم، کسی بھی روکنے والے مادے نے خلیے کے باہر اختزال کو سست نہیں کیا: فیری سائنائڈ کی چکری سرگرمی بغیر کمی کے جاری رہی، اور اندر نہ جانے والے پولیمر کا اختزال بھی ہوتا رہا۔ رکاوٹ بعد کے مرحلے میں تھی۔ سائنائڈ اور ایزائڈ خلیے کے اندر دوبارہ تکسید اور محصور کیے جانے کو روک رہے تھے، سطحی اختزال کو نہیں۔ خلیوں کی زندہ حالت جانچنے والے کنٹرول تجربات نے بھی اس تشریح کی تائید کی، کیونکہ ان کارروائیوں کے دوران خلیوں نے اپنے سائٹوسول کے شناختی خامرے، لیکٹیٹ ڈی ہائیڈروجنیز، کو اندر برقرار رکھا۔ لہٰذا جذب کا ختم ہونا محض زہریلے اثر یا جھلی پھٹنے کا نتیجہ نہیں تھا۔

مقالے کی ایک احتیاط آج بھی لاگو ہوتی ہے۔ نیلے ذرات مرکزے کے گرد تھے، اس کے اندر نہیں، جو ذیلی خلوی عضیوں کے اندر تکسید سے مطابقت رکھتا ہے، لیکن مطالعے نے یہ شناخت نہیں کی کہ وہ کون سے عضیے تھے۔ خلیوں کی دوسری اقسام میں ملتے جلتے نمونوں کو کمزور شواہد کی بنیاد پر لائسوسوم سے منسوب کیا گیا تھا۔ محصور ہونے کو ثابت شدہ سمجھیں، اور اس کے مقام کو عارضی طور پر متعین۔ الیکٹران آگے کہاں جاتے ہیں، اس کا سراغ لگانے والے قارئین مائٹوکانڈریا میں الیکٹران کی منتقلی اور ریڈوکس کا نظم اور مختلف راستوں سے جذب اور تقسیم کی وسیع تر تصویر کا مطالعہ جاری رکھ سکتے ہیں۔

رنگ آمیزی موجود مقدار کا پیمانہ نہیں

ایک تیسرا مطالعہ دکھاتا ہے کہ جب جذب کے اس طریقۂ کار کو حیاتیاتی نتیجے کے ساتھ دیکھا جائے تو کیا ہوتا ہے۔ اسکاٹ اور ان کے ساتھیوں نے پایا کہ میتھائل بیٹا سائیکلوڈیکسٹرین، جو حلقہ نما شکر کا ایک ساختی حلقہ ہے، میتھیلین بلیو سے براہِ راست جڑتا ہے۔ اس کے شمولیتی کمپلیکس کے لیے اتصال کا مستقل تقریباً 310 per molar تھا، جبکہ رنگ دار مادے کے دو سالموں کے جوڑا بنانے کے لیے یہ تقریباً 5846 per molar تھا۔ L929 فائبروبلاسٹس میں اس اتصال نے خلیوں کی رنگ آمیزی اور گلوکوز کے جذب کی تحریک دونوں کو روک دیا: سائیکلوڈیکسٹرین کے ساتھ پہلے سے انکیوبیشن نے نیلی رنگ آمیزی کو روک دیا، اور بعد میں اسے شامل کرنے سے رنگ اترنے کی رفتار تیز ہو گئی۔ جیسے جیسے نیلا بصری سگنل خلیوں سے ختم ہوا، فعال شدہ گلوکوز کی منتقلی بھی اسی کے ساتھ قریبی مطابقت میں کم ہوتی گئی۔

مصنفین نے اس باہمی تعلق کو ایک دیرپا تکسیدی دباؤ کے طریقۂ کار کے بجائے، رنگ دار مادے اور گلوکوز ٹرانسپورٹر کو فعال کرنے والے راستے کے کسی پروٹین کے درمیان براہِ راست تعامل کے حق میں سمجھا۔ یہ نتیجہ معقول ہے، مگر اس کی حدود ہیں۔ تجربہ پروٹین کی شناخت نہیں کرتا، خود ٹرانسپورٹر سے اتصال نہیں دکھاتا، اور رنگ اترنے اور اثر ختم ہونے کے درمیان باہمی تعلق ہر ریڈوکس کے ذریعے ہونے والے راستے کو خارج نہیں کر سکتا۔

پائیدار سبق پیمائش کے بارے میں ہے۔ بصری رنگ آمیزی دکھائی دینے والے، تکسید شدہ، خلیے سے وابستہ رنگ دار مادے کی نشاندہی کرتی ہے۔ یہ بے رنگ اختزال شدہ ذخیرے کو مکمل طور پر نظرانداز کر دیتی ہے، اس لیے ہلکے رنگ والے خلیے میں بھی رنگ دار مادے کی مساوی مقداریں موجود ہو سکتی ہیں۔ شدید رنگ آمیزی والا خلیہ محصور تکسید شدہ مادے کی نشاندہی کرتا ہے، نہ کہ بافت میں مادے کی کل موجود مقدار یا اثر کے حجم کی۔ یہی احتیاط بڑے پیمانے پر بھی لاگو ہوتی ہے: مختلف اقسام کے خلیوں کی رنگ آمیزی کا موازنہ کرنا، یا بافت کے کسی گہرے رنگ والے قطعے کو زیادہ مقدار پہنچنے کا ثبوت سمجھنا، ڈش والے ابتدائی غلط نتیجے کو دہراتا ہے۔ جذب اختزال، انتشار، اور دوبارہ تکسید کا ایک چکر ہے، اور نیلی صورت کی کسی ایک لمحے کی تصویر اس کا صرف ایک پہلو دکھاتی ہے۔ تجربہ گاہ میں رنگ آمیزی اور مادے کی سنبھال کے لیے، اور دی گئی مقدار اور بافت میں پہنچنے والی مقدار سے متعلق دعووں کی تشریح کے لیے، عملی نتائج براہِ راست اسی سے نکلتے ہیں۔