Метиленовий синій і запальна сигналізація: інфламасоми, IL-6 та STAT3

Припустімо, три лабораторії повідомляють, що та сама синя сполука має протизапальну дію. Одна показує зменшення виділення IL-1beta макрофагами. Друга — зменшення кількості ферменту iNOS у клітинах того самого типу. Третя — зниження рівня IL-6 у крові та активності STAT3 у мозку. Виникає спокуса об’єднати ці три результати в одне твердження. Але таке об’єднання приховує суть знахідок.

Кожен результат стосується окремого механізму сигналізації зі своїм пусковим чинником, етапом збирання та вимірюваним показником. Метиленовий синій впливає на кожен механізм у різній точці. Чи поліпшує щось із цього показники здоров’я — окреме питання, яке розглянуто в нашому огляді метиленового синього та запалення. Ця сторінка присвячена саме сигнальним шляхам.

Шлях 1: збирання інфламасоми та каспаза-1

Інфламасома — це білковий каркас, який за потреби формується всередині мієлоїдної клітини. Його складові — сенсор, адаптер під назвою ASC та ефекторний фермент каспаза-1. Після збирання каспаза-1 розщеплює pro-IL-1beta і pro-IL-18 до форм, що секретуються, та може запускати піроптоз — запальну форму загибелі клітин. Тип інфламасоми визначає сенсор: NLRP3 реагує на кристали та пороутворювальні токсини, такі як нігерицин і ATP, NLRC4 реагує на бактеріальний флагелін, AIM2 — на цитозольну дволанцюгову ДНК, а неканонічний шлях — на внутрішньоклітинний ліпополісахарид.

Для активації потрібні два сигнали. Перший сигнал — праймування: ліганд Toll-подібного рецептора запускає NF-kB-залежну транскрипцію NLRP3 і pro-IL-1beta, забезпечуючи наявність необхідних складових. Другий сигнал — збирання: інший пусковий чинник спричиняє олігомеризацію ASC з утворенням точкових агрегатів, розщеплення каспази-1 з утворенням фрагмента p20 та вивільнення зрілого IL-1beta p17. Відомо, що мітохондріальні активні форми кисню та поглинання кристалів беруть участь у формуванні другого сигналу для NLRP3.

У дослідженні широкого пригнічення інфламасом у макрофагах 2017 року метиленовий синій перевіряли на обох етапах сигналізації. У макрофагах кісткового мозку мишей, праймованих ліпополісахаридом, нігерицин, ATP та кристали моноурату натрію спричиняли вивільнення IL-1beta і каспази-1, а також утворення точкових агрегатів ASC. Метиленовий синій у концентраціях від 20 до 200 мікромоляр зменшував усі три показники залежно від дози, не вбиваючи клітини. Флагелін і Salmonella для NLRC4, дволанцюгова ДНК і Listeria для AIM2, а також ліпополісахарид, введений шляхом трансфекції, або живі E. coli для неканонічного шляху давали таку саму картину. Сама сполука не спричиняла вивільнення, а контрольні планшети не показали антибактеріального ефекту, тому результат стосується відповіді організму-хазяїна.

На попередніх етапах шляху виміряли три впливи. Метиленовий синій зменшував утворення мітохондріального супероксиду, спричинене ротеноном, і разом із ним зменшувалося спричинене ротеноном вивільнення IL-1beta. Поглинання флуоресцентних мікросфер знижувалося, що узгоджується зі зменшенням фагоцитозу до розпізнавання кристалів. Репортер під контролем промотора NLRP3 із двома ділянками зв’язування NF-kB демонстрував нижчу активність за наявності метиленового синього, тоді як укорочений промотор без цих ділянок не реагував. У безклітинній пробірці метиленовий синій також безпосередньо знижував активність рекомбінантної людської каспази-1. Додавання сполуки лише під час праймування або лише під час активації все одно зменшувало вивільнення IL-1beta, IL-18 та каспази-1, отже, вплив охоплює обидва етапи.

Досліди на мишах підтвердили цю вибірковість. Летальна доза ліпополісахариду вбивала контрольних тварин протягом кількох годин, тоді як метиленовий синій поліпшував виживаність; рівень IL-1beta у перитонеальній рідині знижувався, але рівень IL-6 у тій самій рідині — ні. У моделі перитоніту, спричиненого Listeria, рівень перитонеального IL-1beta знижувався, тоді як загальна кількість клітин залишалася незмінною. Людські моноцити THP-1 поводилися подібно до мишачих макрофагів для всіх чотирьох типів інфламасом. Результат щодо інфламасоми пояснює дозрівання IL-1beta та IL-18, а не зміни кожного цитокіну. Саме тому форма імунних клітин мозку в експериментах із мікроглією та астроцитами відповідає на інше питання, ніж збирання білкового каркаса.

Шлях 2: транскрипція iNOS через зв’язування NF-kB і STAT1

Індуцибельна синтаза оксиду азоту, або iNOS, майже відсутня у стані спокою, а її транскрипція запускається за потреби. Ліпополісахарид стимулює її переважно через деградацію IkB-alpha з подальшим фосфорилюванням NF-kB та його входженням у ядро. Інтерферон-гамма стимулює її переважно через фосфорилювання STAT1 янус-кіназою з подальшим входженням STAT1 у ядро. Потім кожен фактор зв’язується зі своєю ділянкою на промоторі iNOS. Активність ферменту та індукція гена — окремі точки контролю, і препарат може діяти на одну з них або на обидві.

Дослідження індукції iNOS у макрофагах і мишах з ендотоксемією 2015 року локалізувало ефект на рівні матричної РНК. У клітинах RAW 264.7 і первинних мишачих макрофагах метиленовий синій у концентрації 1 мікромоляр, доданий за 30 хвилин до ліпополісахариду, інтерферону-гамма або обох, зменшував кількість білка та мРНК iNOS протягом 8–24 годин. При цьому рівень нітриту в середовищі знижувався, а життєздатність клітин не погіршувалася. У мишей, яким вводили 25 mg на kg ліпополісахариду, одноразова доза 5 mg на kg за одну годину до цього зменшувала кількість білка та мРНК iNOS у легенях, печінці й серці.

Визначальна деталь — те, що не змінилося. Деградація IkB-alpha, фосфорилювання NF-kB, фосфорилювання STAT1 і накопичення обох факторів у ядрі залишалися незмінними. Порушення відбувалося на один етап пізніше: у ядерних екстрактах виявили менше зв’язування NF-kB із відповідним елементом ДНК після дії ліпополісахариду та менше зв’язування STAT1 після дії інтерферону-гамма. Імунопреципітація хроматину підтвердила зменшення зв’язування обох факторів із промотором iNOS усередині клітин. Рівень фактора некрозу пухлин альфа, промотор якого також використовує NF-kB, теж знижувався. Фактори активувалися й досягали ядра, але слабко зв’язувалися зі своєю цільовою ДНК.

Зверніть увагу на відмінність від шляху 1. Тут ідеться про зв’язування факторів із ДНК, задіяно STAT1, а не STAT3, і вимірюють мРНК, білок та нітрит, а не точкові агрегати ASC і фрагменти каспази-1. Наша карта мішеней метиленового синього в клітинних моделях відокремлює цей транскрипційний рівень від безпосередніх вимірювань ферментативної активності та мітохондріальних показників.

Шлях 3: сироватковий IL-6 та активація STAT3 у тканинах

IL-6 передає сигнал через родину рецепторів gp130 до каскаду янус-кіназа — STAT3. Фосфорильований STAT3 димеризується, входить у ядро та запускає запальні програми, тоді як сам IL-6 є мішенню NF-kB. Отже, вони утворюють петлю зворотного зв’язку, яку часто називають віссю IL-6 — STAT3. Стандартні вимірювані показники — сироватковий IL-6 на початку шляху, співвідношення фосфорильованого STAT3 до загального STAT3 та ефекторні ферменти, такі як iNOS і COX2, на подальших етапах.

У дослідженні IL-6 та STAT3 після введення ліпополісахариду мишам 2023 року цю вісь вимірювали в різних компартментах. Самці мишей C57BL/6 отримували 1 mg на kg ліпополісахариду щодня протягом трьох днів, а через 30 хвилин після кожної дози — 5 або 10 mg на kg метиленового синього. На третій день сироватковий IL-6 був нижчим в обох групах метиленового синього, ніж у групі лише ліпополісахариду, тоді як більшість інших цитокінів у панелі не змінювалися у відповідь на введення сполуки. Співвідношення фосфорильованого STAT3 до загального STAT3 було нижчим у корі мозку, гіпокампі та шкірі вуха. Також спостерігали слабше забарвлення мікроглії за Iba-1, нижчі рівні iNOS і COX2 та часткове зменшення втрати маси тіла.

Тут потрібні два застереження. Нижчий сироватковий IL-6 разом зі зниженим фосфорилюванням STAT3 у тканинах узгоджується з модулюванням осі, але не дає змоги визначити первинну точку впливу: зменшення кількості цитокіну на попередньому етапі, ослаблення рецепторної сигналізації або зміна активності фосфатаз можуть давати те саме співвідношення. Крім того, маса тіла протягом трьох днів гострого впливу — це показник стану цілої тварини, а не оцінка симптомів чи ремісії. Він додає контексту до результатів блот-аналізу, не перетворюючи результат щодо сигналізації на твердження про лікування. Окремі хімічні процеси регулювання мітохондріальних окисно-відновних реакцій відбуваються паралельно з описаними цитокіновими процесами, і їх не слід об’єднувати.

Порівняння шляхів: точки впливу та вимірювані показники

Таблиця запобігає трьом неправомірним перенесенням висновків. Результат щодо точкових агрегатів ASC не доводить результату щодо STAT3. Результат щодо зв’язування STAT1 із промотором iNOS не доводить результату щодо STAT3, хоча обидва білки належать до родини STAT. Результат щодо сироваткового IL-6 не доводить зменшення збирання інфламасоми: у перитонеальному експерименті IL-1beta знижувався, а IL-6 — ні. Для кожного рядка потрібні власний пусковий чинник і власний вимірюваний показник. Саме тому під час читання клітинних, тваринних і клінічних досліджень метиленового синього необхідно зіставляти кожне твердження з рівнем, на якому проводили вимірювання.

Ніщо з цього не встановлює дозування, безпечність або користь для людей. Ліпополісахаридні моделі — це контрольовані пускові впливи для перевірки механізму, а не відтворення хронічних захворювань. Введення сполуки разом із пусковим чинником перевіряє запобігання індукованій зміні, а не зворотний розвиток уже сформованого захворювання. Відокремлюйте цей опис механізмів від результатів у пацієнтів і оцінюйте будь-яке твердження про користь для здоров’я за дослідженням пацієнтів, на якому воно ґрунтується.