Метиленовий синій для фарбування ДНК і РНК: застосування в гелях і на мембранах

Студент проводить електрофорез в агарозному гелі, фарбує його метиленовим синім і нічого не бачить там, де очікував яскраву смугу. За сусіднім лабораторним столом постдок фарбує мембрану для Нозерн-блотингу барвником із тієї самої синьої пляшки й за три хвилини отримує чіткі рибосомні смуги. Студент робить висновок, що електрофорез не вдався. Насправді він вдався. Завдання були різними, і той самий барвник розв'язує їх із різною чутливістю, різним фоном і різними правилами подальшої роботи.

Фарбування ДНК і РНК метиленовим синім ґрунтується на спільній хімії, але має різне призначення. У гелі барвник показує, скільки нуклеїнової кислоти міститься всередині пористої матриці. На мембрані він показує, чи відбулося перенесення і чи рівномірно завантажені доріжки. Коли ця відмінність зрозуміла, протоколи, межі виявлення та обмеження сумісності стають логічними.

Коротка відповідь

Метиленовий синій — це планарний катіонний барвник, який зв'язується з нуклеїновими кислотами нековалентно й оборотно завдяки поєднанню електростатичного притягання до фосфатів, інтеркаляції між парами основ і взаємодії з малою борозенкою. Саме ця оборотність і важлива. Смуги можна забарвити, візуалізувати у видимому світлі, задокументувати, а потім знебарвити або очистити матеріал для клонування, гібридизації чи повторної гібридизації із зондом.

Для фарбування дволанцюгової ДНК метиленовим синім в агарозному гелі стандартний швидкий протокол передбачає 0.02 відсотка w/v (200 мікрограмів на mL) у воді, приблизно 15 хвилин фарбування та приблизно 15 хвилин знебарвлення водою, з переглядом на ілюмінаторі білого світла. Для мембран класичний протокол Нозерн-блотингу передбачає 0.02 до 0.04 відсотка барвника в ацетаті натрію за pH близько 5.2, кілька хвилин фарбування після перенесення й іммобілізації, потім промивання водою та повне знебарвлення перед гібридизацією. Чутливість невисока: за сприятливих умов — від десятків до сотень нанограмів на смугу в гелі, а консервативні рекомендації вказують 0.5 до 1 мікрограма. Це на порядки більше, ніж для броміду етидію та барвників SYBR. Для мембран немає практично корисної єдиної межі виявлення окремого транскрипту, оскільки барвник переважно показує рясно представлену рибосомну РНК і загальну кількість завантаженого матеріалу. Не підміняйте реагент у жодному з цих протоколів роздрібним розчином дієтичної добавки. Валідовані методи передбачають барвник аналітичної чистоти, буфери визначеного складу та роботу без РНКаз, якщо використовується РНК.

Як відбувається зв'язування і де воно вводить в оману

Корисна модель складається з трьох частин. По-перше, позитивно заряджена кільцева система притягується до негативно зарядженого фосфатного остова. Спектроскопічні дослідження показують, що за низької концентрації солей цей електростатичний внесок переважає, тоді як моделювання та молекулярна динаміка вказують на інтеркаляцію і зв'язування в малій борозенці як стабільні способи взаємодії з дволанцюговою ДНК, що узагальнено в спектроскопічному дослідженні зв'язування метиленового синього з ДНК. По-друге, існує певна перевага до GC: моделювання вказує на сприятливість ділянок CpG і GpC, а експерименти виявляють переважне зв'язування з дуплексами, багатими на GC, у роботі про особливості інтеркаляції метиленового синього, хоча AT-дуплекси теж зв'язують барвник. Звичайне фарбування не є специфічним до послідовності. По-третє, одноланцюгові ДНК і РНК зв'язують його переважно через електростатичні взаємодії та стекінг із доступними основами й дуплексними ділянками, тому інтенсивність фарбування залежить від довжини, послідовності та вторинної структури.

Звідси випливають два наслідки. Оскільки зв'язування нековалентне, барвник вимивається. Смуги в поліакриламіді швидко бліднуть, якщо їх спеціально не зафіксувати, а окремий варіант із постійною фіксацією існує саме тому, що звичайне фарбування тимчасове, як описано в роботі Сото й Дрейпера для гелів PAGE. Оскільки барвник є фотосенсибілізатором, тривале яскраве освітлення забарвленої ДНК у присутності кисню може окиснювати гуанін і зрештою спричиняти одноланцюгові розриви — цей механізм докладно описано в роботі про окиснення гуаніну, сенсибілізоване метиленовим синім. Короткий перегляд у білому світлі дає змогу уникнути добре відомого УФ-пошкодження, характерного для класичних методик із бромідом етидію, і це справжня перевага для препаративного виділення. Видиме світло м'якше, але не нешкідливе. Якщо ДНК призначена для клонування, скорочуйте час освітлення. Докладніше про фотохімію, що пояснює це застереження, див. у статті про два шляхи фотохімії метиленового синього. Про окисно-відновну пару та зарядові стани, які пояснюють, чому окиснена форма зв'язується, а відновлена — ні, див. у статті про хімію структури та властивостей метиленового синього.

Завдання перше: фарбування всередині гелів

Фарбування гелю відповідає на одне запитання: чи достатньо в цій смузі нуклеїнової кислоти, щоб побачити її неозброєним оком. Найкраще досліджений випадок — дволанцюгова ДНК в агарозі. Оригінальний метод фарбування гелів метиленовим синім, розроблений Флоресом і колегами, підтвердив придатність швидкого протоколу з 0.02 відсотка барвника для 1-відсоткової агарози та продемонстрував успішне подальше виділення й клонування. Такий самий протокол постачальника наведено на сторінці метиленового синього IBI Scientific, де поруч подано протокол із 0.04 відсотка барвника для мембран і швидкий варіант для гелів.

Практична послідовність:

1. Проведіть електрофорез як зазвичай. Фарбуйте після електрофорезу, а не під час нього, якщо перенесення або роздільну здатність не валідовано для модифікованого методу.
2. Занурте гель у 0.02 відсотка w/v метиленового синього в дистильованій воді приблизно на 15 хвилин із легким перемішуванням.
3. Знебарвлюйте, кілька разів змінюючи воду, загалом приблизно 15 хвилин, доки фон матриці не знизиться й смуги не стануть виразними.
4. Одразу сфотографуйте на ілюмінаторі білого світла.

Агароза й поліакриламід поводяться по-різному. Агароза утримує барвник у матриці, тому знебарвлення є повільним етапом. Тонкі поліакриламідні гелі швидко фарбуються, але так само швидко втрачають барвник, що полегшує препаративне вирізання смуг і ускладнює архівне документування. Синтетичні олігонуклеотиди в поліакриламіді можна виявити за тим самим протоколом із 0.02 відсотка барвника за 20 до 30 хвилин із повторними промиваннями водою, дотримуючись усталених методик PAGE на кшталт Current Protocols. Для препаративних олігонуклеотидів описано дуже розведені варіанти з концентрацією близько 0.0002 відсотка в розведеному TBE протягом кількох годин, але їхня доказова база слабша.

Різниця між ДНК і РНК має значення. Дволанцюгова ДНК забезпечує найсильніше структуроване зв'язування. РНК та одноланцюгова ДНК фарбуються, але слабше й менш передбачувано. Для агарозних гелів РНК із формальдегідом більшість лабораторій пропускає фарбування синім барвником у гелі й спершу переносить РНК на мембрану, а вже потім фарбує її там. Так слабкий сигнал у гелі замінюється чіткішим сигналом на мембрані та документуванням завантаження.

Завдання друге: фарбування на мембранах

Фарбування мембран відповідає на інше запитання: чи відбулося перенесення і чи можна порівнювати доріжки. Класичне застосування — оборотне фарбування Нозерн-блотів за Герріном і Шмідтом: початково використовували 0.04 відсотка барвника в 50 mM ацетаті натрію за pH 5.0 протягом 2 до 3 хвилин із промиванням водою; перед гібридизацією барвник можна було видалити розведеним SDS у SSPE.

Поширений сучасний варіант має таку послідовність:

1. Перенесіть РНК або денатуровану ДНК на нейлон чи нітроцелюлозу, а потім іммобілізуйте УФ-зшиванням або прогріванням, щоб зразок не втрачався під час фарбування.
2. Необов'язковий, але поширений крок: змочіть мембрану в 5-відсотковій оцтовій кислоті приблизно на 15 хвилин.
3. Фарбуйте 5 до 10 хвилин у 0.02 до 0.04 відсотка метиленового синього в 0.3 до 0.5 M ацетаті натрію за pH близько 5.2.
4. Промийте й знебарвлюйте у воді протягом 5 до 15 хвилин, задокументуйте, а потім видаліть залишковий барвник перед гібридизацією.

У Нозерн-блотингу переважає позитивно заряджений нейлон. Нітроцелюлоза також придатна для тієї самої процедури з оцтовою кислотою та ацетатом. Зображення використовують для підтвердження перенесення, порівняння смуг 28S і 18S (або 23S і 16S для бактеріальної РНК), позначення маркерів розміру та стандартів і приблизного документування нормалізації за загальною РНК. В опублікованих методиках Нозерн-блотингу кількісно оцінюють забарвлені рибосомні смуги для перевірки завантаження, зокрема в дослідженні з молочної науки, де використовували рибосомні смуги, забарвлені метиленовим синім, для нормалізації. Мембрани для Саузерн-блотингу можна візуалізувати так само, але застосування цього барвника значно краще усталене для перевірки завантаження й перенесення в Нозерн-блотингу. Крім того, ДНК для Саузерн-блотингу денатурують перед перенесенням, тому показники чутливості для гелів тут не застосовні.

Межі виявлення та фон: де синій барвник програє

Наведене нижче порівняння навмисно приблизне. Ефективність фарбування залежить від відсоткового вмісту гелю, ширини смуги, оптики та ретельності знебарвлення. Сприймайте кожне число як оцінку порядку величини, а не як специфікацію.

Контроль фону визначає, чи буде цей помірний сигнал придатним до використання. Вільний барвник має інтенсивний колір, тому контраст отримують, видаляючи незв'язаний барвник без вимивання зв'язаного. Вища концентрація барвника рідко підвищує чутливість. Переважно вона лише збільшує час знебарвлення. Проведіть серію розведень із конкретними гелем, мембраною та камерою й використовуйте лише той діапазон, у якому інтегральна оптична щільність залишається пропорційною внесеній кількості. Метиленовий синій придатний для напівкількісної нормалізації завантаження. Це не кількісний аналіз із широким динамічним діапазоном, оскільки місткість мембрани, ефективність перенесення, насичення та знебарвлення різняться між доріжками.

Межі сумісності: що витримує фарбування

Можливість клонування після фарбування синім барвником продемонстровано. Флорес і колеги вирізали забарвлені смуги з агарози, виділили ДНК, провели лігування й трансформацію та повідомили про кращі результати клонування, ніж після використання броміду етидію з УФ. Імовірна причина — менше фотопошкодження, а не корисна дія самого барвника. Обмежуйте тривалість освітлення білим світлом і очищуйте виділену ДНК стандартним методом екстракції з гелю.

Для ПЛР і секвенування доказів менше. Залишковий барвник зв'язується з нуклеїновими кислотами, тому перед ферментативними етапами виконайте знебарвлення та очищення. Очікується, що належно очищена ДНК із гелю, забарвленого синім барвником, буде придатною, але допустимий рівень безпосереднього перенесення залишків барвника для різних полімераз і хімічних систем секвенування недостатньо кількісно визначений. Не вважайте це гарантованим.

Гібридизація на блоті сумісна за суворого дотримання порядку: перенесення, іммобілізація, фарбування, документування, знебарвлення, гібридизація. Саме таку послідовність розробили Геррін і Шмідт. Фарбування до перенесення або пропуск знебарвлення — це вже інший метод, який потребує власної валідації. Після видалення барвника стандартне видалення зонда та повторна гібридизація із зондом відбуваються як зазвичай. Про фарбування на клітинному рівні барвниками тієї самої родини та про те, чому підходи до фіксованих мазків не можна переносити на методи для живих клітин, див. атлас фарбування для мікроскопії.

Вирізання смуг придатне для препаративної агарози та олігонуклеотидів у PAGE, локалізованих синім барвником, якщо не використовувати варіант із постійною фіксацією. Електроелюція після знебарвлення хімічно правдоподібна для оборотного зв'язування, але контрольованих даних щодо виходу саме для метиленового синього мало. Після елюції виконайте знесолення або осадження.

Типові повторювані проблеми

Слабкі смуги в гелі зазвичай означають замалу масу для колориметричного фарбування, особливо для коротких одноланцюгових мішеней або РНК. Завантажуйте більше матеріалу, використовуйте свіжий барвник, подовжуйте фарбування, перш ніж підвищувати концентрацію, і раніше припиняйте знебарвлення. Суцільно синій гель без контрасту зазвичай свідчить про надмірне фарбування або замалу кількість змін води. Бліднення смуг у PAGE — очікувана хімічна поведінка, а не невдале фарбування. Фотографуйте швидко. Нерівномірний фон мембрани вказує на складки, бульбашки, відбитки пальців, нерівномірне перемішування або неоднорідне перенесення. Не трактуйте це як нерівне завантаження без контролю гібридизації. Слабкий розмитий малюнок рибосомних смуг може означати деградацію, але також неповне перенесення, замалу кількість загальної РНК (типові доріжки містять від кількох до десятків мікрограмів) або надмірне знебарвлення. Барвник показує рясно представлену рибосомну РНК. Він не показує конкретного транскрипту. Це завдання зонда.

Безпека та поводження без перебільшень

Із метиленовим синім простіше працювати, ніж із бромідом етидію, але він не є нешкідливим. Чинний паспорт безпеки MilliporeSigma відносить барвник до категорії 4 гострої токсичності при пероральному надходженні — шкідливий у разі ковтання — і передбачає утилізацію через затверджену систему поводження з відходами відповідно до паспорта безпеки метиленового синього Sigma-Aldrich. Для броміду етидію наведено серйозніші застереження щодо генотоксичності, зокрема підозру на вплив на статеві клітини в його паспорті безпеки Sigma-Aldrich, а гелі й розчини з ним зазвичай збирають окремо як небезпечні хімічні відходи, як зазначено в посібнику Thermo Fisher із барвників для нуклеїнових кислот. Для обох барвників дотримуйтеся паспортів безпеки та правил установи. Зберігайте сухий барвник щільно закритим і сухим, повторно використовуйте робочий розчин лише в межах, дозволених протоколом, зберігайте забарвлені мембрани сухими між аркушами фільтрувального паперу та фотографуйте гелі до того, як смуги розмиються через дифузію.

Запам'ятайте коротке лабораторне правило. Гелі перевіряють видимість за високого завантаження в білому світлі. Мембрани перевіряють перенесення й завантаження до того, як зонд виконає чутливе виявлення. Один барвник служить обом завданням — із помірною чутливістю, оборотним зв'язуванням і суворим порядком операцій.