Метиленовий синій у дослідженнях даніо-реріо: добавка для утримання та чинник спотворення експерименту

Вода для ікри даніо-реріо часто має слабкий блакитний відтінок, і майже ніхто не записує, чому. Барвник — це метиленовий синій, який додають проти грибків, а більшість протоколів вважає його фоновим компонентом. Однак тут поняття «фон» недоречне. Точніше назвати його неврахованим експериментальним чинником: речовиною, яка присутня в дослідних чашках і відсутня в контролях, фармакологічно активна у застосовуваних концентраціях і здатна змінювати саме ті кінцеві показники, які вимірює експеримент.

Це розмежування визначає все подальше обговорення. Звичайне протигрибкове застосування під час утримання — одне питання. Чи нейтральна ця добавка щодо вашого аналізу — зовсім інше. Нещодавні публікації про даніо-реріо дають заспокійливу відповідь на перше й незручну — на друге.

Що насправді передбачають настанови

Єдиного стандарту немає, і це частина проблеми. Настанови Канадської ради з догляду за тваринами дозволяють 0.5 mg/L, або 0.00005%, у розчині для транспортування ікри та личинок, щоб зменшити ріст грибків. Європейські настанови щодо лабораторних тварин описують утримання ембріонів у середовищі, яке часто містить ті самі 0.00005%. Рецептура E3 від Cold Spring Harbor передбачає вдвічі більше: 1 mg/L, або 0.0001%, як складник рецептури. На цьому тлі впадає в око відсутність барвника в іншому документі: настанова OECD щодо випробування токсичності на ембріонах риб передбачає відновлену воду для розведення та досліджувану хімічну речовину, але не рекомендує метиленовий синій ані у версії 2013 року, ані в пізнішій редакції. Отже, одна лабораторія вирощує ембріони даніо-реріо в блакитній воді з метиленовим синім із перших годин життя, інша проводить регуляторне випробування на ембріонах у безбарвній воді, і обидві називають своє середовище нормальним. Кожен, хто порівнює результати різних лабораторій або об'єднує історичні контрольні дані, успадковує цю неузгодженість.

Для розуміння концентрацій: 0.00005% — це приблизно 1.56 мікромоляра, а 0.0001% — приблизно 3.13 мікромоляра. Це низькі значення, і є спокуса вважати їх надто низькими, щоб вони мали значення. Наведені нижче дослідження перевіряють саме це припущення і саме за цих концентрацій.

Читачі, які прийшли сюди з акваріумістики, а не з лабораторії, зустрічають ту саму молекулу в іншому контексті, описаному в акваріумному посібнику з метиленового синього. Хімія спільна; пояснення того, як барвник переносить електрони в клітинах, показує, чому окисно-відновно активна сполука раз у раз з'являється в публікаціях про метаболізм. Подальше обговорення стосується саме води для ікри даніо-реріо з метиленовим синім.

Метаболізм: напрям ефекту змінюється залежно від стадії

У найінформативнішому дослідженні даніо-реріо, що розвивалися нормально, піддавали впливу барвника з першого дня життя до 5 днів після запліднення та вимірювали окисний метаболізм на кожній стадії, як описано в опублікованому звіті про експерименти з метаболізмом ембріонів. Цю закономірність варто описати ретельно, адже напрям ефекту змінюється на протилежний.

На 1 день після запліднення базальне споживання кисню зростало в ембріонів, що зазнавали впливу, за обох концентрацій, застосовуваних під час утримання. На 2 день потенціал мітохондріальної мембрани в поверхневому шарі личинок був підвищений за впливу 0.00005%, 0.0001% і 0.0003%. До 4–5 дня, після вилуплення, напрям змінився: окисні енерговитрати знижувалися незалежно від того, чи вплив був безперервним від запліднення, чи лише гострим — із 3 до 4 дня. Паралельно на 1 і 4 день зменшувалася кількість транскриптів субодиниць мітохондріальних дихальних комплексів, а також транскриптів, пов'язаних зі стероїдогенезом і глюконеогенезом.

Ще два спостереження уточнюють картину. За вищої концентрації, застосовуваної під час утримання, вилуплення відбувалося трохи раніше: ембріони під впливом барвника випереджали контроль на 2 день, а до 3 дня контрольні ембріони їх наздоганяли. Водночас сама стресова вісь, схоже, залишалася неушкодженою: коли 5-денних личинок піддавали стресу через закручування води, загальний вміст кортизолу в організмі нормально зростав в обох групах. Отже, за цих доз барвник не є загальною отрутою для розвитку й не пригнічує всі фізіологічні реакції. Він змінює енергетичний метаболізм залежно від стадії: підвищує його до вилуплення та знижує після.

Поведінка: чому два дослідження розходяться і чому обидва можуть бути правильними

Публікації про поведінку здаються суперечливими, доки не зіставити схеми впливу. В одному дослідженні безпеки щодо розвитку та поведінки ембріони приблизно з 6 годин після запліднення піддавали впливу концентрацій до 10 мікромолярів, щодня оновлювали розчини до 4 дня, потім переносили личинок у середовище без барвника на 5 і 6 день та на 6 день перевіряли рухову активність у тесті з чергуванням світла й темряви. Результат: жодного значущого впливу на смертність, вилуплення чи морфологію, а також жодного впливу обробки на рухову активність. Автори обґрунтовано рекомендували 10 мікромолярів як верхню межу за їхніх умов.

Друга група, частина авторів якої також брала участь у дослідженні метаболізму, організувала вплив так, як це відбувається за звичайного утримання: барвник був присутній уже з 2–3 годин після запліднення, середовище щодня частково оновлювали, а поведінку вимірювали під час впливу або невдовзі після нього. За тих самих звичайних концентрацій личинки демонстрували знижену рухову активність у 24-годинному тесті; результат відтворювався в різних лініях і лабораторіях. Дослідження спотворення поведінкових результатів пов'язало ефект із серотонінергічним тонусом, що узгоджується з відомим пригніченням моноаміноксидази цим барвником. Найпоказовіше те, що ембріональне середовище з метиленовим синім маскувало очікувану реакцію рухової активності на флуоксетин — селективний інгібітор зворотного захоплення серотоніну (SSRI). Отже, скринінговий тест у блакитній воді може не виявити ефект препарату, який був би помітний у безбарвній воді.

Справжньої суперечності немає. Сполука може не залишати виявлюваного залишкового ефекту через два дні після видалення з середовища в одному тесті й водночас залишатися активною, поки присутня, в іншому. Практичний висновок такий: нульовий результат обґрунтовує верхню межу концентрації, а не твердження про нейтральність, тоді як позитивний результат описує важливий ризик — активний вплив у період вимірювання саме за тієї схеми, яку використовує більшість лабораторій.

Окисно-відновний барвник в окисно-відновному аналізі

Ще одна пастка заслуговує на окремий абзац, оскільки вона спотворює роботу вимірювальної системи, а не стан тварини. Аналіз енерговитрат Alamar Blue сам ґрунтується на окисно-відновній хімії: резазурин відновлюється до флуоресцентного резоруфіну. Метиленовий синій також бере участь в окисно-відновних реакціях. У безклітинних контролях обидві концентрації, застосовувані під час утримання, через 24 години незначно, але статистично значуще знижували флуоресценцію Alamar Blue. В експериментах на тваринах ембріони після впливу барвника перед аналізом промивали щонайменше три рази в середовищі без барвника, а біологічний ефект у личинок після вилуплення перевищував безклітинну інтерференцію. Отже, справедливі обидва твердження: у промитих тварин зберігається реальний метаболічний ефект, а невидалений барвник додає до нього прямий хімічний артефакт. Контролі мають розділяти ці два явища, інакше жодне з чисел нічого не означає. Загальні рекомендації щодо інтерпретації результатів аналізів на основі барвників тут особливо важливі.

Хронологія стадій розвитку

Оригінальний матеріал для цієї статті. Якщо не зазначено інше, йдеться про дві стандартні концентрації для утримання: 0.00005% і 0.0001%.

Варто запам'ятати раннє зростання та пізніше зниження метаболічних показників, а також поведінкові ефекти, які присутні під час впливу й не виявляються після виведення речовини в єдиному тесті, де це перевіряли.

Контрольний список для планування контролів

Другий оригінальний матеріал. Використовуйте його, коли протоколи утримання даніо-реріо з метиленовим синім перетинаються з експериментом.

1. Описуйте барвник як реагент, а не як воду. Зазначайте концентрацію і у відсотках, і в мікромолярах, початок і кінець впливу в годинах або днях після запліднення, графік оновлення середовища та тривалість періоду без барвника перед кожним вимірюванням.
2. Узгоджуйте контролі з дослідницьким питанням. Для дослідження випробовуваної хімічної речовини потрібні контролі без барвника; для дослідження умов утримання — групи без барвника та з ним із реєстрацією протигрибкового результату, оскільки жодне з наведених досліджень не вимірювало протигрибкову ефективність.
3. Промивайте перед окисно-відновними аналізами, а потім перевіряйте. Промивайте щонайменше три рази в середовищі без барвника та паралельно проводьте безклітинний контроль із барвником і реагентом, оскільки барвник безпосередньо знижує сигнал Alamar Blue.
4. Вважайте поведінкові та моноамінові показники особливо вразливими до спотворення. У дослідженнях рухової активності, реакції переляку, тривогоподібної поведінки, антидепресантів та інгібіторів МАО слід уникати барвника під час вимірювання або продемонструвати його нейтральність щодо конкретного показника; період без барвника тривалістю від одного до двох днів усував один ефект на рухову активність, але для інших експериментальних схем це не доведено.
5. Вважайте метаболічні та мітохондріальні показники особливо вразливими до спотворення на кожній стадії. Споживання кисню, енерговитрати, мембранний потенціал і кількість транскриптів дихального ланцюга змінюються за концентрацій для утримання, причому до й після вилуплення — у протилежних напрямках.
6. Не переносіть висновки про нейтральність між різними схемами досліджень. Нульовий результат після видалення барвника не поширюється на безперервний вплив; відсутність морфологічного ефекту не поширюється на метаболізм або взаємодію з препаратом; результат для однієї лінії, температури чи тривалості аналізу не поширюється на інші.
7. Зазначайте настанову, якої ви дотримувалися, та її альтернативу. Прямо називайте концентрації за CCAC, європейськими настановами або Cold Spring Harbor і вказуйте, де випробування OECD на ембріонах не передбачає барвника, щоб читач міг зрозуміти, у яких умовах утримували ваших тварин.

Усе це не є аргументом проти використання барвника для збереження життєздатності ікри. Це аргумент проти того, щоб рішення щодо утримання непомітно й без перевірки впливало на дані. Блакитний колір у чашці створює молекула з фармакологічною дією, а найімовірніше спотворення загрожує саме високопродуктивним метаболічним і нейроповедінковим скринінгам, для яких нині віддають перевагу молодим даніо-реріо. Фіксуйте її використання, контролюйте вплив, видаляйте перед вимірюванням і перевіряйте аналіз, у якому вона може непомітно брати участь.