Метиленовий синій і БАС: чому результати різняться між експериментальними моделями

Пошукайте інформацію про метиленовий синій і БАС, і ви знайдете два твердження, які, здається, суперечать одне одному. Перше стверджує, що синій барвник захищав нейрони в моделях БАС. Друге — що він не мав жодного ефекту в мишачій моделі БАС. Обидва твердження посилаються на реальні наукові публікації, і обидві публікації заслуговують на серйозну увагу. Суперечність зникає, щойно сформулювати принцип, що лежить в основі кожного експерименту: модель визначає межі твердження.

Результат у черва — це твердження про черва. Результат у личинки риби — це твердження про личинку риби. Жоден із них не є твердженням про пацієнта, доки його не підкріплено даними про перебіг хвороби у ссавців. У цій статті зіставлено дві найчастіше цитовані публікації, щоб ви могли побачити, чому їхні відповіді різняться.

Два експерименти в одній таблиці

Тримайте цю таблицю перед очима під час читання. У ній зібрано всі важливі відмінності між дослідженнями.

Відрізняються генетика, види, шлях введення, час початку впливу та кінцеві точки. Генотип — лише одна з п’яти відмінностей, тож ця пара досліджень не може довести, що метиленовий синій вибірково діє на один із механізмів БАС. Вона доводить дещо вужче, але все одно корисне: виражене відновлення за раннього безпосереднього впливу в простих моделях не відтворилося за хронічного перорального введення протягом перебігу хвороби у ссавців.

Позитивний результат: що показало дослідження на червах і рибах

У дослідженні на червах і рибах 2012 року забезпечували експресію мутантного людського TDP-43 або FUS у моторних нейронах червів і вводили мРНК мутантних людських білків в ембріони риб. Це моделі протеотоксичності. Вони відтворюють токсичний вплив мутантного білка на рух і форму нейронів протягом кількох днів, а не повний перебіг БАС у дорослої людини протягом років.

Лікування починали дуже рано. Черви від моменту вилуплення росли на агарі з метиленовим синім. Ембріони риб перебували в розчині препарату протягом ночі, починаючи через 24 години після запліднення, а поведінку перевіряли приблизно через два дні. Між препаратом і нейроном не було гематоенцефалічного бар’єра, який існує у ссавців, і рівень препарату в плазмі чи мозку не вимірювали.

За цих умов ефекти були вираженими й послідовними. І 6, і 60 μM зменшували віковий параліч у червів із TDP-43 та FUS. На 12-й день дорослого життя приблизно 80 відсотків червів із TDP-43, які не отримували лікування, були паралізовані, порівняно з приблизно 10 відсотками червів, яких лікували від моменту вилуплення. Синаптичний тест указував на те саме: черви з TDP-43 мали підвищену чутливість до альдикарбу — препарату, який використовують для оцінювання нервово-м’язової передачі, — а метиленовий синій наближав реакцію до норми. Кількість відростків моторних нейронів із дегенеративними змінами зменшувалася, причому найвиразніший ефект спостерігали за 60 μM. У риб плавання у відповідь на дотик суттєво поліпшувалося, а вкорочені аксони моторних нейронів за 30 або 60 μM відростали, наближаючись до нормальної довжини, хоча відновлення було частковим, а не повним.

Дані щодо окисного стресу узгоджувалися з антиоксидантним поясненням. У мутантних червів і риб показники активних форм кисню були підвищеними та знижувалися під час лікування, а нормальні черви, які отримували метиленовий синій, значно довше виживали за впливу прооксиданту, ніж черви без лікування. Проте важливі два обмеження. Загальні рівні мутантних білків TDP-43 і FUS не знижувалися, а кількість білкових агрегатів у дослідженні безпосередньо не визначали. Отже, воно показує функціональне відновлення, але не доводить усунення агрегатів. Усім, хто стежить за тим, як зазвичай формулюють окисно-відновні та мітохондріальні гіпотези, варто вважати цей механізм підкріпленим даними, але не остаточно встановленим.

Найпоказовішою деталлю був час початку лікування. Коли автори відкладали його до 5-го дня дорослого життя, частка паралізованих червів на 12-й день становила приблизно 55 відсотків замість приблизно 10 відсотків за лікування від моменту вилуплення. Той самий препарат, той самий черв, та сама мутація — значно менший ефект. Ранній профілактичний вплив забезпечував значну частину спостережуваного позитивного ефекту.

Нульовий результат: що показало дослідження на мишах із SOD1

Дослідження на мишах 2011 року ставило складніше запитання в системі із суворішими критеріями оцінювання. У конгенних мишей із SOD1 G93A хвороба прогресує від тремору задніх кінцівок через порушення ходи та втрату рефлексу перевертання до заздалегідь визначеної термінальної кінцевої точки. Лікування починали до появи симптомів, на 45-й день, і продовжували щодня, а спостерігачі оцінювали неврологічний стан за шкалою від 0 до 6. Це експеримент, що охоплює весь перебіг хвороби, тому він ближчий до того, що важливо для пацієнта, ніж будь-яка крива розвитку паралічу в черва.

Основні результати були нульовими. Загалом початок хвороби припадав на 121-й день у контрольній групі та на 124-й день у групі метиленового синього; ця різниця не була значущою. Виживаність до кінцевої стадії становила 167 днів проти 170 днів — також без значущої різниці. Кілька вторинних аналізів давали результати на користь лікування: у самиць спостерігали затримку початку хвороби приблизно на 7 днів, а тварини, які отримували лікування, проводили дещо більше часу на легших стадіях і менше — на тяжких. З огляду на малі підгрупи за статтю та численні порівняння стадій ці результати радше слугують підставою для гіпотез, ніж доказом. Не підраховували нейрони, не проводили аналіз агрегації SOD1 і не вимірювали маркери окисного стресу чи запалення. Тому дослідження також не може сказати, чи препарат досяг своїх мішеней і не подіяв, чи за цієї дози взагалі з ними не взаємодіяв. Перевіряли лише одну дозу.

Самі автори вказали на найсуттєвіше обмеження, яке діє в обох напрямах. Моделі SOD1 G93A з високою кількістю копій добре відтворюють хворобу, спричинену токсичністю SOD1, але ця форма становить лише невелику частку сімейного БАС і біологічно відрізняється від більшості спорадичних випадків. Вони запропонували повторно перевіряти перспективні сполуки в моделях ссавців на основі TDP-43. Відтоді ситуація з цією пропозицією ускладнилася: автори дослідження на червах і рибах зазначають, що окреме дослідження метиленового синього на мишах із TDP-43 також не показало поліпшення рухових показників. Отже, сполука може демонструвати виражений ефект в одній системі TDP-43 і жодного — в іншій системі TDP-43. Система має не менше значення, ніж ген.

Чому поліпшення в черва чи риби не доводить користі для пацієнтів

Сприймайте кожну модель як відповідь на окреме запитання.

По-перше, відрізняється біологія. TDP-43 і FUS — це білки, що зв’язують нуклеїнові кислоти й мають спільні генетичні взаємодії в цих простих системах, тоді як токсичність SOD1 реалізується через частково відмінні безпосередні механізми. Препарат, який послаблює один вид протеотоксичного стресу, не обов’язково послаблює інший. А успіх за надмірної експресії в ембріонів не обов’язково передбачає успіх за повільної нейродегенерації в дорослому віці із запаленням, залученням глії та системним погіршенням стану.

По-друге, відрізняється вплив препарату. Постійне перебування в середовищі з мікромолярними концентраціями — не те саме, що пероральне введення. Між проковтнутою дозою та моторним нейроном спинного мозку стоять всмоктування в кишечнику, метаболізм першого проходження, зв’язування з білками плазми, проникнення в мозок і виведення. У жодному з досліджень не вимірювали рівні препарату в нервовій системі, тож жодне не дає змоги зіставити свої концентрації з концентраціями в іншому.

По-третє, відрізняється час початку лікування. Позитивні ефекти в червів і риб значною мірою залежали від початку лікування до накопичення патологічних змін. У мишей лікування також починали до появи симптомів, що є сильною стороною дослідження, проте в людей воно майже завжди починалося б після появи симптомів, тобто ще пізніше. Профілактичний ефект у дводенному тесті на ембріонах — це відправна точка для досліджень, а не модель клінічного застосування.

По-четверте, відрізняються кінцеві точки. Параліч на 12-й день, чутливість до альдикарбу, довжина аксона в мікрометрах і відстань плавання — це фенотипові показники, безпосередньо пов’язані з досліджуваними процесами. Початок хвороби та виживаність у ссавців відображають сукупний вплив усіх компенсаторних і ускладнювальних процесів в організмі. Препарати нерідко змінюють безпосередні показники, не змінюючи виживаності, тому й використовують кінцеві точки часу до події у ссавців.

Читачі, яким потрібен контрольний список для оцінювання наступного гучного заголовка, можуть скористатися матеріалом про те, як читати доклінічні дослідження: з’ясуйте вид, трансген, дозу та шлях введення, чи вимірювали рівні препарату, коли починали лікування відносно розвитку патології, чи кінцевою точкою був короткостроковий фенотип або перебіг хвороби та чи відтворила ефект друга лабораторія. Саме в ширшій доказовій базі щодо метиленового синього в людей слід перевіряти, чи переріс хоч якийсь із цих ранніх сигналів у клінічні дані.

Що це означає для пацієнтів і родин

Із цих публікацій не випливає жодного усталеного протоколу застосування метиленового синього при БАС. Дослідження з позитивним результатом підтримує подальше вивчення окисних і синаптичних механізмів у біології TDP-43 та FUS. Дослідження з нульовим результатом не дає підстав очікувати зміни перебігу хвороби за хронічного перорального введення з таким рівнем впливу при захворюванні типу SOD1. Разом вони описують неузгодженість результатів між моделями, а не рекомендацію щодо лікування.

Безпека потребує такої самої тверезої оцінки, як і ефективність. Дослідження БАС на мишах нічого не говорять про безпечне дозування для людей, а метиленовий синій має реальні ризики гемолізу за дефіциту G6PD і серотонінової токсичності в поєднанні із серотонінергічними препаратами. Підозру на дефіцит G6PD, поточний прийом антидепресантів і будь-які заплановані зміни в прийомі ліків слід обговорювати з лікарем. Так само варто розглянути загальні дані про безпеку метиленового синього, перш ніж діяти на підставі гучних повідомлень про лабораторні результати.

Підсумок уміщується в одному реченні. Метиленовий синій за раннього впливу забезпечував виражене відновлення фенотипових показників у червів і личинок риб із TDP-43 та FUS, але практично не впливав на початок хвороби чи виживаність у дослідженні з хронічним пероральним введенням мишам із SOD1. Отже, чесне тлумачення — це залежні від моделі дані, які не обґрунтовують застосування в пацієнтів.