Аналізи дріжджів із метиленовим синім: підрахунок живих клітин чи вимірювання часу дихання

На лабораторному столі стоять дві пробірки. Обидві сині. В одній сині клітини під мікроскопом означають мертві дріжджі. В іншій перехід вмісту пробірки від синього до безбарвного означає, що дріжджі живі й дихають. Той самий барвник, протилежні тлумачення. Якщо переплутати ці два аналізи, усі висновки зміняться на протилежні.

Саме цій відмінності присвячено всю статтю. Метиленовий синій — окисно-відновний барвник: в окисненій формі він синій, а у відновленій — безбарвний лейкометиленовий синій. Підрахунок життєздатних клітин використовує цю хімічну властивість під час короткого мікроскопічного спостереження. Дослід із диханням використовує її в реакції в усьому об’ємі суміші, перебіг якої вимірюють у часі. Кожному потрібні власний протокол, власні контролі та власний критичний підхід.

Підрахунок життєздатних клітин: коротке фарбування й негайна оцінка

Найбільш стандартизований варіант — протокол, застосовуваний у пивоварінні. Приготуйте метиленовий синій із концентрацією 0.01% w/v у 2% розчині цитрату натрію, змішайте його 1:1 із суспензією дріжджів і дослідіть суміш після короткого фіксованого інтервалу. Опубліковані інтервали різняться: від 1 до 2 хвилин у посібнику Brewing Science Institute до приблизно 5 хвилин у дослідницьких протоколах, тоді як метод OIV для мікробіології вина вимагає провести огляд у межах 10 хвилин. Кінцева концентрація барвника в суміші для підрахунку становить близько 0.005%. Заповніть удосконалену камеру Нойбауера й за збільшення приблизно 400x класифікуйте темно-сині клітини як нежиттєздатні, а незабарвлені — як життєздатні. За методом OIV світло-сині клітини зараховують до живих, що вже вказує на проблему суб’єктивності, розглянуту нижче.

Концентрацію клітин визначають за геометрією камери. Якщо підраховано весь центральний квадрат зі стороною 1 mm, кількість клітин на mL дорівнює N, помноженому на коефіцієнт розведення та на 10^4, де N — кількість клітин у цій ділянці, як зазначено в методах ASBC для дріжджів. Життєздатність обчислюють простіше: кількість незабарвлених клітин ділять на загальну кількість клітин і множать на 100. Для оцінки життєздатності підрахуйте приблизно 400 клітин, відповідно до порівняльного дослідження пивоварних методів у FEMS та практики OIV. Послідовно застосовуйте одне правило обліку клітин на межах, наприклад враховуйте клітини на нижній і лівій лініях сітки та не враховуйте ті, що на верхній і правій.

Правило обліку бруньок потрібно визначити до початку підрахунку. За поширеною домовленістю бруньку рахують як окрему клітину, коли вона сягає приблизно половини розміру материнської клітини; меншу бруньку рахують разом із материнською. Яке б правило ви не обрали, застосовуйте його до кожного квадрата й запишіть у бланку, щоб наступний виконавець міг його відтворити.

Бланк підрахунку (роздрукуйте)

Цей бланк — оригінальний матеріал цієї статті. Перенесіть його в лабораторний журнал або роздрукуйте по одному примірнику на зразок.

Життєздатність (%) = 100 x незабарвлені / (незабарвлені + темно-сині). Загальна кількість клітин на mL = N x коефіцієнт розведення x 10^4, де N отримано для визначеної ділянки камери. Записуйте тривалість фарбування поруч із результатом, адже показник життєздатності без зазначення часу не є відтворюваним.

Чому показники життєздатності змінюються

Перший чинник спотворення — час, і він діє в обидва боки. Метаболічно активні клітини відновлюють барвник, тому рання оцінка може застати живі клітини до завершення його відновлення й помилково зарахувати їх до мертвих. Однак тривалий контакт із барвником сам по собі токсичний і призводить до появи справді пошкоджених синіх клітин, створюючи хибне забарвлення, що вказує на загибель. Тому навчальний лабораторний протокол передбачає оцінювання в межах 5 хвилин, як зазначено в навчальному протоколі роботи з дріжджами Університету Вісконсину. Коректно стверджувати, що оцінка за метиленовим синім залежить від часу, тож оберіть один короткий інтервал і дотримуйтеся його для кожного зразка в серії.

Зразки з низькою життєздатністю мають друге джерело систематичної похибки. Стандартизований метод попереджає, що метиленовий синій може завищувати справжню життєздатність за її рівня нижче приблизно 80%, оскільки клітини, які ще відновлюють барвник, не обов’язково зберігають здатність до розмноження. У пивоварній літературі описано таку саму ненадійність за істотного зниження життєздатності. Розглядайте метиленовий синій як засіб швидкої приблизної оцінки, а важливі рішення за низької життєздатності, наприклад щодо повторного внесення культури, підтверджуйте підрахунком колоній на чашках або додатковим фарбуванням.

Третій чинник — вплив матриці зразка. Метод OIV виконують за pH близько 4.6; він попереджає, що зразки з високою буферною ємністю та низьким pH перешкоджають належній поведінці барвника, а також не рекомендує аналіз за вмісту цукру понад 100 g/L, коли клітини мають оманливо світло-синє забарвлення. Експериментальне порівняння pH фарбування виявило суттєві зміни чутливості в дослідженому діапазоні, що узгоджується з дослідженням залежності методу з метиленовим синім від pH. Сторонні частинки — окрема пастка: забарвлені частинки в забруднених заторах схожі на мертві клітини й збільшують розбіжності між виконавцями.

Цю мінливість підтверджено кількісно, а не лише окремими спостереженнями. У шестимісячному випробуванні на пивоварні, описаному в порівняльному дослідженні дріжджів у FEMS, стандартне відхилення для парних вимірювань із метиленовим синім становило в середньому 6.1% проти 0.2% для проточної цитометрії з оксонолом, а результати двох виконавців для одного зразка різнилися до 13 відсоткових пунктів. Кількісне порівняння методів оцінки життєздатності 2023 року показало істотно вищу точність флуоресцентної мікроскопії та проточної цитометрії, водночас засвідчивши, що характеристики методів залежать від виду та матриці. Класичний опис методу авторства Painting і Kirsop (PMID 24430080) залишається базовим джерелом, а ширший огляд аналізів життєздатності та фізіологічної активності дріжджів (PMID 25154541) відносить метиленовий синій до допоміжних, а не остаточних тестів. Трипановий синій тут не є автоматично кращою заміною: він вказує на втрату цілісності мембрани, тоді як метиленовий синій відображає поглинання барвника та відновну активність, тому клітини у стресовому стані можуть отримати різну класифікацію за використання цих двох барвників.

Дослід із диханням: виміряйте час зникнення синього кольору

Другий аналіз не потребує мікроскопа. Дріжджі, глюкозу та розведений метиленовий синій поміщають у закриту пробірку й вимірюють час до зникнення синього кольору. У процесі метаболізму клітини утворюють відновні еквіваленти, які переводять синій барвник у безбарвну форму, тоді як розчинений кисень знову його окиснює. Коли клітини знижують вміст кисню, відновлення починає переважати, і вміст пробірки знебарвлюється. Отже, кінцева точка відображає баланс між диханням, концентрацією барвника та доступністю кисню; результат слід подавати як час відновлення або знебарвлення метиленового синього, а не як пряму швидкість споживання молекулярного кисню.

Використовуйте значно більш розведений барвник, ніж для визначення життєздатності, щоб отримати зручний часовий інтервал. Посібник AQA з обов’язкових практичних робіт рівня A level добре стандартизує цей дослід: 1 g глюкози на 100 mL води, нагрітої приблизно до 30 C, 5 g сухих дріжджів, доданих безпосередньо перед використанням, і робочий розчин барвника з концентрацією близько 0.001%, приготований розведенням 0.1 mL 1% вихідного розчину до 100 mL. Змішайте 2 mL суспензії дріжджів із глюкозою та 2 mL робочого розчину барвника, витримайте до встановлення температури досліду, струсіть один раз протягом 10 секунд, запустіть таймер і більше не струшуйте. Струшування знову вводить кисень і повертає синє забарвлення, що є найбільшим процедурним артефактом. AQA зазначає, що зазвичай суміш має знебарвитися приблизно за 5 хвилин за 35 C; середні значення у випробуваннях становили 275 s за 20 C, 128 s за 35 C і 145 s за 45 C. Це приклади з однієї експериментальної схеми, а не універсальні орієнтири. Кількісний зв’язок між швидкістю відновлення та метаболічно активними дріжджами за контрольованих умов підтверджують спеціалізовані дослідження відновлення, зокрема робота, індексована як PMID 25773544, і дослідження механізму в Yeast (2014).

Демонстрація часової динаміки (оригінальний матеріал)

Наведена нижче таблиця — оригінальна демонстрація, підготовлена для цієї статті за описаною вище схемою AQA: 2 mL суміші дріжджів із глюкозою та 2 mL робочого розчину барвника з концентрацією близько 0.001%, одне струшування протягом 10 секунд, потім інкубація без перемішування. Наведено приклади показників у форматі, який має використовувати група студентів; індекс швидкості визначено як 1, поділену на час знебарвлення в секундах. Проведіть дослід із такими самими пробірками та замініть ці записи виміряними значеннями.

Побудуйте графік залежності індексу швидкості від температури для пробірок A, B і C. Крива спочатку зростає, а потім виходить на плато або спадає — це очікувана закономірність для процесу, зумовленого ферментами, а не пряма лінія. Пробірки D, E та F не є точками даних на цій кривій. Це контролі, які дають змогу її інтерпретувати.

Контролі, що надають змісту кожному аналізу

Кожен дослід із диханням потребує трьох супровідних проб. Прокип’ячені або вбиті дріжджі з глюкозою та барвником мають залишатися синіми, підтверджуючи, що швидке відновлення залежить від метаболізму живих клітин. Живі дріжджі з барвником без доданої глюкози — це субстратний контроль, але й тут слід очікувати повільного знебарвлення, оскільки дріжджі використовують ендогенні запаси. Глюкоза з барвником без дріжджів — хімічна холоста проба, необхідна тому, що глюкоза в лужному середовищі може відновлювати метиленовий синій без будь-яких клітин.

Підрахунок життєздатних клітин потребує іншого виду контролю: сталості процедури. Той самий вихідний розчин барвника, те саме співвідношення змішування, та сама тривалість фарбування, та сама ділянка камери, ті самі правила обліку бруньок і клітин на межах, а за можливості — підрахунок наосліп. Коли результати двох виконавців різняться на десять пунктів, бланк зазвичай виявляє причину: різний час, різний поріг синього забарвлення або різні правила обліку бруньок. Техніки підготовки та огляду забарвлених клітин пов’язані з методами простого фарбування бактерій, а ширший огляд того, що барвник позначає в різних зразках, міститься в атласі мікроскопічного фарбування. Фізичні основи кількісної оцінки інтенсивності синього кольору пояснює довідник із поглинання із зазначеними умовами: кожен коефіцієнт потрібно наводити разом із даними про розчинник, pH і концентрацію.

Обирайте аналіз відповідно до запитання. Скільки клітин живі саме зараз — це питання підрахунку, на яке відповідають за допомогою мікроскопа й бланка. Наскільки активно дихає ця культура — це питання кінетики, на яке відповідають за допомогою секундоміра та контрольованих пробірок. Метиленовий синій придатний для обох завдань, але ніколи не для обох одночасно в тій самій пробірці.