Хто розробив пурпурове фарбування крові? Метиленовий синій, Малаховський, Романовський і Гімза

Еозин червоний. Метиленовий синій — синій. Змішайте їх, нанесіть суміш на висушений мазок крові, і його окремі ділянки стануть пурпуровими.

Не всі ділянки. У якісному препараті ядра лейкоцитів набувають червоно-пурпурового кольору, і всередині малярійного паразита хроматин забарвлюється так само, тоді як навколишні еритроцити залишаються рожевими, а цитоплазма — сіро-блакитною. Саме пурпуровий колір дає змогу розрізняти типи клітин.

У жодній пляшці немає пурпурового барвника. Цей колір з’являється лише тоді, коли певний продукт розпаду метиленового синього зустрічається з еозином на предметному склі. У 1880-х і 1890-х роках ніхто не знав про існування цього продукту, не кажучи вже про те, що він собою являє. Дослідники, які намагалися отримати цей колір, працювали з нечистими барвниками, поодинці й без надійного способу з’ясувати, що міститься в пляшці після двох місяців зберігання на полиці.

Саме тому запитання в заголовку має більше ніж одну обґрунтовану відповідь і саме тому відповідь змінилася у 2011 році.

Що ставало видно зі зміною суміші

Метод фарбування не винайшли за один раз. Його розвивали поступово. Кожна зміна суміші давала рівно одну нову порцію видимої інформації, і послідовність цих спостережень — найзрозуміліший спосіб простежити історію.

Важлива саме закономірність в останній колонці. Кожен крок уперед розширював колірну гаму, а кожне її розширення робило видимою ще одну структуру. Пурпуровий колір — не прикраса методу; це різниця між тим, щоб побачити наявність паразита, і тим, щоб побачити, з чого він складається. Як сам барвник потрапив із фарбувального заводу BASF у медицину — це довша історія зі своїми документами. Повна послідовність, наведена вище, із джерелом для кожного запису зберігається як хронологія внесків дослідників із посиланнями на джерела.

Рисунок: ті самі шість сумішей, зображені через те, що було в посудині, і те, що з цього вийшло. Кола позначають барвники; блоки під ними — кольори, які ці барвники могли утворювати в мазку крові. До 1890 року червоно-пурпурового блоку немає ніде, а після нього він є скрізь.

Людина, яка навмисно застосувала буру

Ернст Малаховський був лікарем у Бреслау, нині Вроцлаві. Упродовж своєї кар’єри він займався приватною практикою та працював у невеликій клініці, якою керував разом із колегою, а лабораторні дослідження проводив у вільний час. Він народився у Стшельні 12 березня 1857 року, вивчав медицину в університеті Бреслау й від 1882 до 1887 року працював асистентом у відділенні внутрішньої медицини лікарні Всіх Святих, тоді другої за розміром лікарні Німеччини.

У 1888 році він почав із подвійного фарбування Хенцинського й Плена. У препараті, виготовленому в 1889 році, він побачив, що хроматин ядра плазмодія забарвлюється інакше, ніж цитоплазма, але потім не зміг відтворити результат. Він спробував підкислити метиленовий синій, що лише погіршило ситуацію. Потім спробував підлужнити його бурою — і це спрацьовувало щоразу. Він публічно продемонстрував метод 15 червня 1890 року, а в серпні 1891 року опублікував докладніший опис, зокрема вказівку щодо бури. Він зазначив, що фарбування тривало двадцять чотири години, а результати легко відтворювалися.

Двадцять чотири години — довгий термін для діагностичної лабораторії, а його стаття не зосереджувалася на пурпурово-червоному кольорі ядра паразита. Хоч би якою була причина, ніхто не підхопив навмисне підлужнення метиленового синього, доки Нохт не зробив цього знову в 1898 році. Малаховський більше ніколи не писав про фарбування крові.

Причина того, що донедавна про нього було так мало відомо, пов’язана з архівами, а не з якоюсь таємницею. У медичній літературі майже не залишилося слідів його життя, а те, що збереглося, дійшло одним шляхом. Його донька Марі виїхала з Німеччини до Лондона в 1939 році, служила в британській армії й оселилася в Канаді, а її зібрання родинних документів зрештою потрапило до Інституту Лео Бека в Нью-Йорку. Її брат Лео загинув у Першій світовій війні. Її сестру Єву у квітні 1942 року депортували з Бреслау до транзитного табору Ізбіца, і вона так і не повернулася. Її мати Гедвіґ наклала на себе руки 22 квітня 1942 року, не бажаючи чекати на таку саму депортацію. Малаховський помер у 1934 році, ще до всіх цих подій.

Родинну історію з таким завершенням перестають згадувати. Дві статті, які повернули Малаховського в історію розвитку цього фарбування, обидві опубліковані у 2011 році, були підготовлені на основі архівних документів у Познані й Вроцлаві та паперів Марі в Нью-Йорку.

Запліснявіла пляшка й щасливий випадок для росіянина

Дмитро Романовський вивчав медицину у Військово-медичній академії в Санкт-Петербурзі й більшу частину своєї кар’єри досліджував малярію. У 1890 році він опублікував метод, який на папері був майже тотожним методу Хенцинського: незмінений метиленовий синій та еозин, тільки еозину було трохи більше.

У вересні 1891 року він опублікував метод, який зробив його відомим, а вирішальна деталь загубилася серед інструкцій. Найкращі результати він отримував із наявного розчину метиленового синього — запасного розчину, який простояв понад два місяці й укрився пліснявою. Пліснява та тривале зберігання частково деметилювали барвник. Романовський цього не знав і не міг контролювати, а інші дослідники, які випробували його метод, не могли отримати пурпурового кольору. Його дисертацію було подано в Санкт-Петербурзі в червні 1891 року, тому в загальноприйнятому викладі роком відкриття вважають 1891-й.

Демонстрація Малаховського відбулася в червні 1890 року, більш ніж на рік раніше, і його метод працював завдяки цілеспрямованим діям.

Чому метод назвали не на честь того дослідника

Аргументи на користь Малаховського зібрали Крістіне Крафтс, Ернст Гемпельманн і Барбара Олексин, і вони спираються на чотири обставини. Дата публічної демонстрації: червень 1890 року проти вересня 1891-го. Слово навмисно проти слова випадково. Те, що Малаховський опублікував свій метод, включно з бурою, тоді як метод Романовського залежав від неконтрольованої змінної. І спостереження, що опис ядра плазмодія разом із пурпуровим кольором, який його виявляв, фактично зник із літератури на сім років, бо ніхто не міг відтворити випадковий варіант.

Свій висновок вони висловлюють прямо. У біографічній статті вони називають таке приписування заслуги «пародією на справедливість» і цитують Ральфа Ліллі, який у 1978 році писав, що «можливо, нам слід називати цю родину методів фарбування методами Малаховського».

Це твердження оскаржують, як зазвичай буває з претензіями на першість, і варто пояснити суть суперечки, а не намагатися її розв’язати. Суперечка про пріоритет має визначити, що саме було відкриттям. Якщо відкриття — це пурпуровий колір, Малаховський має ранішу документально підтверджену демонстрацію. Якщо відкриття — це опублікований метод, обидва дослідники опублікували його в 1891 році, а назву отримав метод Романовського. Якщо відкриття — це пояснення, жоден із них не може на нього претендувати, бо жоден не знав, що дозрівання є деметилюванням, і жоден не міг сказати, чому взагалі з’являвся цей колір. Саме останній пункт популярні виклади оминають. Активним компонентом була домішка, яку ніхто не ідентифікував, а перша людина, що навмисно отримала цей колір, зробила це за відтворюваним емпіричним рецептом, а не завдяки розумінню того, як він працює.

Дві статті 2011 року — найповніший опублікований виклад аргументів на користь Малаховського, і обидві можна безкоштовно прочитати через PubMed: розгорнутий огляд — PMID 21235291, біографічну статтю — PMID 21660627. Запис огляду в PubMed також містить посилання на коментар до нього, опублікований у тому самому журналі пізніше того ж року в 86(5):366. Це доречне нагадування, що аргументи почали оскаржувати в друці відразу після їхньої появи.

Ця суперечка точно не стосується розбіжностей у хімії. Усі її учасники погоджуються щодо того, чим є пурпуровий колір і які компоненти його утворюють. Розбіжності стосуються того, хто досяг результату першим, і того, чи можна взагалі вважати досягненням випадковість, яку ніхто не міг повторити.

Що дали пізніші дослідники

Якщо Малаховський першим отримав пурпуровий колір, чому фарбування носить імена Романовського, Райта й Гімзи?

Тому що суміш, яка спрацьовує один раз у руках свого винахідника, ще не є реактивом. Подальша робота перетворила примхливу суміш на засіб, яким лаборант в іншій країні міг скористатися у звичайний вівторок.

Нохт дійшов до цього через міркування. Не отримавши надійного результату від простого нейтрального барвника, він зробив висновок, що пурпуровий колір має походити від чогось у метиленовому синьому, що не є самим метиленовим синім, і почав це шукати. Унна вже помітив, що старі розчини метиленового синього забарвлювали гранули опасистих клітин у червоний колір, і припустив, що під час дозрівання барвника утворюється нова речовина. Бернтсен у 1885 році показав, що в лужних умовах від метиленового синього відщеплюються метильні групи, а утворені продукти — це те, що ми нині називаємо азурами. Нохт екстрагував активну фракцію хлороформом і міг назвати її лише червоним із метиленового синього; Міхаеліс у 1901 році назвав її азуром I. Дженнер розв’язав практичну проблему. Повторне розчинення осаду метиленового синього й еозину в абсолютному метанолі давало єдиний стабільний розчин, який фіксував мазок одночасно з фарбуванням і усував потребу в тепловій фіксації. Лейшман і Ройтер поєднали поліхромний барвник зі спиртовим розчинником і водночас отримали стабільність та пурпуровий колір. Райт замінив дванадцятигодинну інкубацію при 65 °C і десять днів витримування однією годиною в потоці пари. Гімза взагалі перестав покладатися на випадково дозрілий розчин: він використовував відміряні кількості відомих барвників із гліцерином у метанолі, щоб препарат витримував тропічну спеку. Він так і не опублікував спосіб отримання чистого метиленового азуру. Він продавав його лабораторії доктора Ґрюблера в Лейпцигу, яка реалізовувала його як азур I і стверджувала, що лише її версія є справжнім барвником Гімзи.

Про склад того азуру сперечаються й досі. Одні вважають, що це був просто поліхромний метиленовий синій, інші — що він містив багато azure B. Відповідь з’явилася під час війни. Коли німецькі барвники стали недоступними, команда Служби громадського здоров’я США — Ральф Ліллі разом із Морісом Роу та Еме Вілкокс — встановила, що найкраще фарбування давали три розділені компоненти: немодифікований метиленовий синій, продукт його деметилювання azure B та еозин. Azure B замінив недоступний азур I, і ці три компоненти досі є основою барвника, який сьогодні використовують для діагностики малярії.

Хімія взаємодії цих трьох компонентів на предметному склі — окреме питання й тема іншої сторінки. Стаття про ролі барвників і хімію фарбування за Романовським пояснює, що роблять azure B та еозин і чому їхня пара утворює колір, якого жоден із них не дає окремо. А сторінка про мікроскопію та лабораторне застосування розглядає практичний бік: що показує певний препарат і як оцінити, чи підходить конкретний продукт для методу, який ви плануєте застосувати.

Частина історії, яка досі актуальна

Одна деталь цієї історії не втратила актуальності після 1902 року. Приблизно п’ятдесят років найважливішим компонентом стандартного у світі барвника для діагностики малярії була безіменна домішка. Вона з’являлася випадково, її кількість різнилася від пляшки до пляшки, певний час її склад був комерційною таємницею, а щодо її частки сперечалися до 1940-х років. Люди, які користувалися цим барвником, не були недбалими. Вони не мали способу дізнатися, що міститься в пляшці.

Сучасний варіант тієї самої проблеми — специфікація, яка описує лише частину матеріалу. Відповідність USP — це шлях до найвищої чистоти, яку пропонує ринок, адже це повний опублікований стандарт, а не окремий вимір: ідентифікація, чистота, органічні домішки, зокрема азурові барвники, залишкові розчинники, елементні домішки, залишок після прожарювання, допустимі межі мікробного забруднення та бактеріальні ендотоксини. Blupreme отримує метиленовий синій від фармацевтичного виробника й публікує повний сертифікат аналізу, щоб кожен пункт цього переліку можна було перевірити, а не просто прийняти на віру. Сертифікат, який наводить результат аналізу на важкі метали й називає це відповідністю USP, — сучасний аналог пляшки з написом «дозрілий метиленовий синій»: можливо, це чудовий реактив, але етикетка не розповідає, що в ньому міститься.