Інтерпретація вигляду колоній E. coli та інших мікроорганізмів на агарі EMB

Студент висіває невідомий мікроорганізм штриховим методом на еозин-метиленовий синій агар, інкубує його протягом ночі й повертається до чашки з темними колоніями із зеленим полиском. У лабораторному журналі з’являється запис: «E. coli, підтверджено». Цей запис стверджує більше, ніж можна обґрунтувати за самою чашкою. Чашка демонструє фенотип росту й ферментації за певних умов. Видова належність — окремий висновок, який потребує окремих доказів.

Цей посібник розглядає результати на агарі EMB як завдання з інтерпретації. Він пояснює принцип роботи середовища, знайомить з ілюстративним атласом чашок і контролями та окреслює випадки, у яких хрестоматійна картина вводить в оману.

Принцип роботи середовища

Агар EMB є водночас селективним і диференційним. Барвники еозин Y та метиленовий синій пригнічують багато грампозитивних мікроорганізмів, тому середовище сприяє росту грамнегативних. Ці самі барвники діють як індикатори: коли мікроорганізм ферментує наявний цукор і утворює достатню кількість кислоти локально, колонія інтенсивно поглинає барвник і набуває кольору від темно-фіолетового до синьо-чорного. За інтенсивного утворення кислоти на поверхні колонії може з’являтися металевий зелений переливчастий блиск. Протокол ASM для чашок з еозин-метиленовим синім агаром описує це поєднання селективності й диференціації та містить еталонні фотографії для навчання.

Перед інтерпретацією будь-якого результату важливо перевірити одну деталь: яку рецептуру середовища використано. Старіша рецептура Holt Harris Teague містить лактозу й сахарозу, тоді як EMB за Levine містить лише лактозу. Мікроорганізм, який ферментує сахарозу, але не лактозу, як-от багато ізолятів Serratia marcescens, може мати різний вигляд на цих двох варіантах середовища. Документація виробника щодо середовищ EMB прямо вказує на цю відмінність рецептур. Записуйте виробника й рецептуру в лабораторному журналі разом із результатом.

Приготований незасіяний агар EMB зазвичай має колір від червоно-коричневого до червонувато-фіолетового, іноді із зеленуватим відтінком або дрібним осадом. Цей фоновий колір не є ознакою росту. Порівнюйте кожен результат із незасіяною чашкою або задокументованим вихідним виглядом середовища та оцінюйте чашку первинного посіву приблизно через 18–24 години аеробної інкубації за 35–37 C, якщо навчальний протокол не передбачає іншого. Триваліша інкубація може змінити зовнішні ознаки ферментації.

Як оглядати чашку

Використовуйте два типи освітлення. Спочатку огляньте чашку у відбитому світлі або за косого освітлення й нахиліть її: металевий блиск є переливчастим і може з’являтися або зникати залежно від кута огляду. Потім огляньте її у світлі, що проходить крізь чашку, щоб оцінити колір колоній і темні центри. Працюйте з добре ізольованими колоніями, оскільки щільний ріст і сусідні колонії змінюють локальне накопичення кислоти та можуть послаблювати або посилювати забарвлення. Добірка зображень ASM безпосередньо демонструє це: E. coli у змішаній культурі може втратити очікуваний блиск, оскільки навколишні мікроорганізми змінюють кислотність середовища.

Використовуйте контролі щоразу, коли це дозволяє навчальне завдання. Типовий навчальний набір включає E. coli ATCC 25922 для фенотипу із синьо-чорним забарвленням і металевим блиском, мікроорганізм, що не ферментує лактозу, наприклад Salmonella Typhimurium ATCC 14028 або Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, для безбарвного фенотипу та грампозитивний мікроорганізм, наприклад Enterococcus faecalis або Staphylococcus aureus, як контроль пригнічення, як зазначено у стандартних таблицях контролю якості середовищ EMB. Якщо позитивний контроль не має блиску, спочатку перевірте умови інкубації, щільність росту або рецептуру, перш ніж робити припущення щодо невідомого мікроорганізму.

Ілюстративний атлас чашок

Наведені нижче зображення чашок — це згенеровані ілюстрації, а не фотографії реальних культур. Вони демонструють характерні ознаки, які слід шукати, а не точний відтінок конкретного штаму. Порівнюйте їх з еталонними фотографіями ASM та реальними чашками з навчальної лабораторії.

Чашка 1: Escherichia coli на агарі EMB, інтенсивна ферментація лактози

E. coli на агарі EMB зазвичай має колір від темно-фіолетового до синьо-чорного, часто з темним центром і металевим зеленим блиском унаслідок інтенсивного утворення кислоти. Блиск — це відома ознака, яку шукають студенти, але його слід розглядати як додатковий доказ, а не визначальну характеристику. Інтенсивність блиску залежить від штаму, часу інкубації, щільності колоній і кута огляду. Відсутність блиску не виключає E. coli, а темна колонія без блиску може вказувати на кілька інших мікроорганізмів, що ферментують цукри. Для будь-якої подальшої роботи вибирайте добре ізольовану колонію, а не оцінюйте ділянку зі щільним ростом.

Чашка 2: Klebsiella pneumoniae на агарі EMB, слизові колонії мікроорганізму, що ферментує цукри

Klebsiella pneumoniae на агарі EMB зазвичай утворює великі, лискучі, слизові колонії з відтінками від рожево-фіолетового до коричнево-фіолетового, часто з темними центрами, але зазвичай без вираженого металевого блиску. Подібна морфологія трапляється у споріднених мікроорганізмів, що ферментують цукри, наприклад Enterobacter. Слизова консистенція та розмір колоній є частиною оцінки: маленька плоска рожева колонія має інше значення, ніж велика опукла слизова. Як і у випадку E. coli, чашка дає підстави припустити фенотип ферментації, а визначення на рівні виду потребує біохімічного підтвердження, описаного нижче.

Чашка 3: Salmonella на агарі EMB та інші мікроорганізми, що не ферментують лактозу, безбарвні колонії

Salmonella на агарі EMB та споріднені мікроорганізми, що не ферментують лактозу, зокрема Shigella й багато ізолятів Pseudomonas, зазвичай утворюють колонії від безбарвних до напівпрозорих або блідо-бурштинових. Деякі рецептури та умови надають слабкого рожевуватого відтінку, тому блідо-рожева колонія не обов’язково свідчить про ферментацію. EMB не відрізняє Salmonella від Shigella чи інших мікроорганізмів, що не ферментують лактозу; це розрізнення потребує подальших тестів. Також слід враховувати, що задокументовано лактозопозитивні штами Salmonella з металевими колоніями, подібними до E. coli, — ще одна причина, чому одна чашка не дає остаточної відповіді.

Чашка 4: Serratia marcescens і пастка рецептури

Serratia marcescens заслуговує на окремий розділ, оскільки студенти часто очікують червоних колоній і через це неправильно інтерпретують чашку. Більшість клінічних ізолятів не ферментують лактозу, тому на EMB за Levine вони зазвичай виглядають блідими або слабко забарвленими. Оскільки багато ізолятів ферментують сахарозу, рецептура з її вмістом може давати темніше забарвлення або виразнішу реакцію, пов’язану з утворенням кислоти. Не варто також очікувати класичного червоного пігменту продигіозину за 35–37 C; за температури інкубації утворення пігменту нестабільне. Якщо протокол згадує Serratia marcescens на агарі EMB, перевірте, яку рецептуру він має на увазі. Огляд метаболізму Serratia узагальнює відсутність ферментації лактози та варіабельність ферментації сахарози, що лежать в основі цієї пастки.

Чашка 5: контролі та мікроорганізми, ріст яких пригнічено

Грампозитивні мікроорганізми, як-от Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus і Bacillus, зазвичай не ростуть на агарі EMB або їхній ріст значно пригнічений, хоча пригнічення не є абсолютним для кожного штаму. Набір контролів робить інтерпретацію обґрунтованою: контроль E. coli має демонструвати добрий ріст із синьо-чорним забарвленням і блиском, контроль мікроорганізму, що не ферментує лактозу, — безбарвний ріст, а контроль пригнічення — незначний ріст або його відсутність. Якщо контроль пригнічення добре росте, селективність не спрацювала, і всі інші результати для цієї партії викликають сумнів. Методи фарбування відповідають на інше запитання, ніж поживні середовища; щодо фарбування препаратів у лабораторії дивіться атлас фарбування метиленовим синім.

Порівняння з урахуванням меж інтерпретації

Три речення підсумовують оманливі зовнішні ознаки. Темне забарвлення не означає E. coli, оскільки Klebsiella, Enterobacter та інші мікроорганізми, що ферментують цукри, утворюють темні центри без блиску. Рожеве забарвлення не означає Klebsiella, оскільки мікроорганізми з помірною або повільною ферментацією та деякі мікроорганізми, які зазвичай вважають неферментувальними, мають рожевий або лавандовий колір. Блиск не є остаточним підтвердженням E. coli, оскільки інші мікроорганізми з інтенсивною ферментацією також можуть його утворювати. Навчальний протокол і його зображення змішаних культур ілюструють кожну з цих помилок.

Межі підтвердження

Агар EMB показує фенотип, а не вид. Різні мікроорганізми можуть мати однаковий вигляд колоній, а один мікроорганізм може відхилятися від своєї хрестоматійної картини залежно від штаму, віку культури, щільності росту, рецептури та інкубації. Саме тому в навчальних і клінічних робочих процесах морфологію на EMB розглядають як підставу для попереднього припущення.

Обґрунтований порядок роботи для студента такий: описати ізольовану колонію (розмір, колір, центр, блиск за косого освітлення, слизовий характер), записати рецептуру, час і температуру інкубації та результати контролів; потім пересіяти добре ізольовану колонію для отримання чистої культури перед будь-яким підтверджувальним тестом. Зазвичай подальше дослідження включає фарбування за Грамом і реакції IMViC для попередньої ідентифікації E. coli та коліформних бактерій, TSI або KIA та специфічні для мікроорганізму біохімічні панелі для кишкових мікроорганізмів, а також серологічну ідентифікацію, MALDI TOF чи інший валідований метод ідентифікації, якщо цього потребує завдання. Щоб зрозуміти місце EMB серед селективних і диференційних середовищ для кишкових мікроорганізмів, ознайомтеся зі вступними матеріалами про такі поживні середовища та подальше фарбування за Грамом. Щодо пов’язаного питання про те, що може й чого не може довести синє фарбування препарату, атлас фарбування метиленовим синім так само розмежовує спостереження та висновок.

Записуйте спостереження перед висновком. «Темні синьо-чорні колонії із зеленим блиском, що залежить від кута огляду, на EMB за Levine через 24 години, що узгоджується з інтенсивною ферментацією лактози» — обґрунтований запис. «E. coli, підтверджено» потребує етапу підтвердження, якого сама чашка забезпечити не може.