Метилен зәңгәре күзәнәкләргә ничек керә: кайтарылу, кабат оксидлашу, сеңү

Эндотелий күзәнәкләре культурасы метилен зәңгәрен сеңдергәндә, күзгә иң ачык күренгән аңлатма шул ук вакытта ялгыш та була. Тирәлек зәңгәр төсен югалта, күзәнәкләрдә зәңгәр гранулалар барлыкка килә — димәк, буягыч мембрана аша зәңгәр молекула рәвешендә үткәндер. Тәҗрибәләр исә башка нәрсә күрсәтә. Зәңгәр форма мембрана аша диярлек үтми. Аның аша төссез форма үтә, ә эчтә күренгән зәңгәр төс, матдә кергәннән соң, күзәнәкнең үзендә барлыкка килә.

Бу кире күренеш мөһим, чөнки ул буялуның нәрсәне күрсәтә алуын һәм нәрсәне күрсәтә алмавын билгели. Зәңгәр гранулалар кабат оксидлашкан һәм органеллаларда тотылып калган оксидлашкан буягычны күрсәтә. Алар күзәнәктәге буягычның гомуми күләмен дә, кайтарылган форма запасын да күрсәтми һәм биологик тәэсирне үлчәми. Ни өчен шулай икәнен аңлау өчен, өч адымны күзәтик: өслектә кайтарылу, кайтарылган форманың диффузиясе, эчтә кабат оксидлашу һәм тотылып калу.

Ике форма үзләрен төрле молекулалар кебек тота

Оксидлашкан метилен зәңгәре — уңай корылмалы яссы боҗралар системасы. Ул суда эри, якынча 600–700 нанометр тирәсендәге яктылыкны көчле йота һәм зәңгәр булып күренә. Төп мәсьәлә — корылмада. Корылмалы, су белән җиңел бәйләнешкә керүче молекула липид мембрана аша җиңел генә үтә алмый, шуңа күрә әдәбиятта саклык белән «мембрана аша чагыштырмача начар үтә» дип язалар, «бөтенләй үтми» дип түгел.

Кайтарылган метилен зәңгәре, ягъни лейкометилен зәңгәре, төссез, корылмасыз һәм майда эри торган була. Корылма югалгач, мембрана киртә булудан туктый. Кайтарылган молекула аның аша җиңел диффузияләнә, ә эчтә оксидлаштыру сәләте көчлерәк булган бүлеккә эләккәч, яңадан электроннарын югалтып, зәңгәр, корылмалы һәм эчтә тотылып калган формага кайта ала. Димәк, буягычның оксидлашу-кайтарылу химиясе шул ук вакытта аның күчү механизмы да булып тора. Электроннар саны үзгәрсә, мембрана аша үтү сәләте дә үзгәрә.

Беренче адым өчен электроннар күзәнәкнең үзеннән килә. Имезүчеләр күзәнәкләре электроннарны плазма мембранасы аша күчерә: кайтаручы эквивалентлар күзәнәк эчендәге донорлардан өслектәге акцепторларга таба хәрәкәт итә. Плазма мембранасы аша бара торган бу активлык — күзәнәкнең гадәти функциясе, һәм ул күзәнәк төрләренең күбесендә бар. Тиазин буягычлары белән эшләүче эндотелий өслеге редуктазасы бер мөһим яктан башка шундый системаларга охшаган: соңрак бара торган адымнарны туктатучы дозаларда цианид һәм азид булганда да ул эшләвен дәвам итә. Бу процессларны аеру — бөтен аңлатманың төп ноктасы.

Башта фазалар арасында бүленүне өйрәнгәннәр, һәм ул сеңүне тулысынча диярлек аңлаткан

1929 елда Рокфеллер институтында Мариан Ирвин гадирәк сорау куйган. Бәлки, буягычның керүе — аның су белән күзәнәкнең майлы катламнары арасында бүленүе генәдер, ә лаборатория тәҗрибәсендә ул майлы катламнар урынына хлороформ катламын кулланып буладыр. Аның үтеп керүне спектрофотометрия белән өйрәнгән тикшеренүләрендә буягычның судагы эремәләрен хлороформ белән селкетеп кушканнар һәм органик фазага күчкән матдәне тере суүсем күзәнәкләренә кергән матдә белән чагыштырганнар.

Бу эшнең ике нәтиҗәсе әле дә игътибарга лаек. Беренчедән, сатудагы метилен зәңгәре эремәләрендә хәзер Azure B дип аталган триметилтионин булган, һәм бу кушылма метилен зәңгәренең үзенә караганда тизрәк үтеп кергән. Бу бигрәк тә липидларда эри торган ирекле нигез формасы өстенлек иткән селтеле pH шартларында ачык күренгән. Метилен зәңгәре керә дип күренгән кайбер очраклар чынлыкта Azure B матдәсенең сайлап керүе булган. Икенчедән, pH, ионлашу халәтен билгеләп, нәтиҗәне дә билгеләгән, ә зарарланган күзәнәкләр зарарланмаганнарына караганда күпкә күбрәк буягыч үткәргән. Бүленү коэффициентлары һәм корылма халәте ясалма системаның да, тере күзәнәкнең дә нәрсә сеңдерүен билгеләгән, ә алар арасындагы охшашлык күзәнәк чигендә су булмаган катламнар бар дигән фикерне хуплаган.

Бу модель липидларның һәм ионлашуның ролен алдан күргән, ләкин ул ике очракны аера алмаган: буягыч үз формасында фазалар арасында бүленәме, әллә өслектә химик үзгәреш кичереп, башка формада үтә дә эчтә яңадан элекке формасына кайтамы. Аларны аеру өчен башка тәҗрибә кирәк булган, һәм ул җитмеш елдан соң үпкә эндотелиенда үткәрелгән.

Тышта кайтарылу, эчтә тотылып калу

Меркер һәм хезмәттәшләре культурада үстерелгән сыер үпкә артериясе эндотелий күзәнәкләре белән эшләгән һәм өч адымлы эзлеклелек тәкъдим иткән: оксидлашкан буягыч күзәнәк өслегендә төссез липофиль формасына кадәр кайтарыла, кайтарылган форма эчкә диффузияләнә, ә күзәнәк эчендә кабат оксидлашу мембрана аша үтә алмый торган оксидлашкан форманы яңадан барлыкка китерә, һәм ул туплана. Аннары аларның эндотелийның тиазин буягычларын сеңдерүен өйрәнгән тикшеренүе бу эзлеклелекне аерым урыннарда өзү юлы белән сынаган.

Беренче чара феррицианид булган — ул күзәнәккә керә алмый торган электрон акцепторы. Өслек ферментлары зәңгәр буягычны күзәнәк тышында төссез формасына кадәр кайтарганда, феррицианид ул электроннарны кире алып, буягыч мембрананы үткәнче үк тирәлектә зәңгәр форманы яңадан барлыкка китерә ала. Феррицианид артык күләмдә булганда (10 микромоляр буягычка 50–500 микромоляр феррицианид), буягычның сеңүе диярлек туктаган, һәм феррицианид беткәч кенә сеңү гадәти тизлегендә яңадан башланган. Кинетика шул ук күренешне икенче яктан да раслаган. Феррицианид якынча даими тизлектә югалган; бу кабат кулланыла ала торган арадашчыга электроннар бирүче тотрыклы өслек кайтарылу агымына туры килгән. Шул ук вакытта күзәнәк тышындагы буягыч, запасы кимегән саен, экспоненциаль рәвештә югалган. Даими агым белән кими баручы запасның бергә күзәтелүе феррицианид сигналының буягыч молекулаларының эремәдән китүен түгел, ә өзлексез кайтарылуны күрсәтүен аңлата.

Икенче чара мембрананы үтү адымын бөтенләй бетергән. Төркем тиазиннарның якын туганы булган толуидин зәңгәре O матдәсен зур полиакриламид чылбырына ялгаган. Ул чылбыр ике оксидлашу халәтендә дә күзәнәккә керә алмаслык зур булган. Күзәнәкләр бәйләп куелган буягычны барыбер кайтарган. Димәк, кайтарылу өчен күзәнәк эченә керү кирәк түгел. Моның өчен җаваплы система өслектә урнашкан яки аның белән электр бәйләнешендә тора.

Аннары мәкаләнең исемен билгеләгән аеру ясалган. 2 миллимоляр концентрациядәге цианид һәм азид буягыч туплануын көчле бастырган, ә микроскоп астында гадәттә төшне уратып торган куе зәңгәр һәм шәмәхә тупланмалар диярлек юкка чыккан. Әмма ике ингибиторның берсе дә күзәнәк тышындагы кайтарылуны акрынайтмаган: феррицианид әйләнеше кимеми дәвам иткән, мембрана аша үтми торган полимер да һаман кайтарылган. Блок соңрак этапта булган. Цианид һәм азид өслектәге кайтарылуны түгел, ә күзәнәк эчендә кабат оксидлашуны һәм аерым урыннарда тотылып калуны туктаткан. Күзәнәкләрнең яшәүчәнлеген тикшерү бу аңлатманы раслаган: әлеге эшкәртүләр вакытында күзәнәкләр үзләренең цитозоль маркер ферментын — лактатдегидрогеназаны — саклап калган. Димәк, сеңүнең кимүе агулану яки мембрананың өзелүе белән генә аңлатылмаган.

Мәкаләдәге бер искәрмә әле дә көчендә. Зәңгәр тупланмалар төш эчендә түгел, аның тирәсендә урнашкан; бу күзәнәк эчендәге органеллаларда оксидлашу белән туры килә, ләкин тикшеренү аларның кайсы органеллалар икәнен ачыкламаган. Башка күзәнәк төрләрендәге охшаш күренешләрне, җитәрлек дәлилсез, лизосомалар белән бәйләгәннәр. Тотылып калуны расланган күренеш дип, ә аның төгәл урынын әлегә фараз гына дип кабул итегез. Электроннарның аннары кая китүен күзәтүче укучылар митохондрияләрдә электроннар күчеше һәм оксидлашу-кайтарылу процесслары турында, шулай ук керү юлына карап сеңү һәм таралуның киңрәк күренеше турында укый ала.

Буялу матдә тәэсиренә дучар булуны үлчәми

Өченче тикшеренү бу сеңү механизмы биологик күрсәткеч белән чагыштырылганда нәрсә булуын күрсәтә. Скотт һәм хезмәттәшләре боҗра рәвешендәге шикәр торы — метил-бета-циклодекстринның метилен зәңгәрен турыдан-туры бәйләвен ачыклаган. Кертелү комплексы өчен ассоциация константасы якынча 310 кире моляр булган, ә буягычның димерлашуы өчен ул якынча 5846 кире моляр тәшкил иткән. L929 фибробластларында бу бәйләнеш күзәнәкләрнең буялуын да, глюкоза сеңүенең стимуллашуын да блоклаган: циклодекстрин белән алдан инкубацияләү зәңгәргә буялуны булдырмаган, ә аны соңыннан өстәү төснең югалуын тизләткән. Оптик зәңгәр сигнал күзәнәкләрдән югалган саен, активлашкан глюкоза күчеше дә аның белән тыгыз параллель рәвештә кимегән.

Авторлар бу корреляцияне озак дәвам итүче оксидатив стресс механизмына караганда, буягычның глюкоза ташучысы активлашу юлындагы бер аксым белән турыдан-туры үзара тәэсир итүен күбрәк хуплый дип аңлаткан. Бу нәтиҗә нигезле, ләкин аның чикләре бар. Тәҗрибә аксымны атамый, ташучының үзенә бәйләнүне күрсәтми, ә төс югалу белән тәэсир югалу арасындагы корреляция оксидлашу-кайтарылу аша бара торган барлык юлларны да кире кага алмый.

Моннан чыга торган төп сабак — үлчәү турында. Оптик буялу күзәнәк белән бәйләнгән, күренә торган оксидлашкан буягычны күрсәтә. Ул төссез кайтарылган форма запасын бөтенләй күрми. Шуңа күрә тонык төсле күзәнәктә дә буягыч эквивалентлары булырга мөмкин, ә көчле буялган күзәнәк тукымадагы матдәнең гомуми күләмен яки тәэсир зурлыгын түгел, тотылып калган оксидлашкан буягычны күрсәтә. Шул ук саклык киңрәк масштабта да кирәк: төрле күзәнәк төрләренең буялуын чагыштыру яки тукыманың куе буялган кисемтәсен матдә тәэсиренә күбрәк дучар булу дәлиле дип кабул итү культура савытындагы беренчел ялгышны кабатлый. Сеңү — кайтарылу, диффузия һәм кабат оксидлашу циклы, ә зәңгәр форманың теләсә кайсы аерым мизгелдәге күренеше аның бер өлешен генә күрсәтә. Лабораториядә буяу һәм буягыч белән эш итү өчен, шулай ук доза һәм матдә тәэсиренә дучар булу турындагы раслауларны аңлату өчен практик нәтиҗәләр шуннан турыдан-туры килеп чыга.