Makale
Sütte metilen mavisi indirgenme testi: ilkesi ve sınırlamaları
Bir öğrenci iki süt tüpünü kaldırır. Biri bir saatte beyazlaşmıştır. Diğeri beş saat boyunca mavi kalmıştır. Mavi olanı gösterip içmenin güvenli olduğunu söyler.
Bu sonuç, testin yanlış kavrandığını gösterir. Sütte metilen mavisi testi güvenliği belirlemez. Sabit koşullar altında o tüpteki mikrobiyal popülasyonun redoks potansiyelini ne kadar hızlı düşürdüğünü gösterir. Yavaş indirgenme, numunenin toplam metabolik aktivitesinin düşük olduğu anlamına gelir. Hangi organizmaların bulunduğu, aralarında bir patojen olup olmadığı veya sütün doğru şekilde pastörize edilip edilmediği hakkında hiçbir şey söylemez.
Bu ayrım önemlidir, çünkü test ikna edici görünür. Mavi renk kaybolur. Bir saat, sayısal bir sonuç verir. Sayılar, gösterdiklerinden fazlasını çıkarsamaya yöneltir. Bu makale, yararlı yorumu korur ve güvenli olmayan yorumu önler.
İndirgenme gerçekte neyi ölçer?
Metilen mavisi, yükseltgenmiş durumda mavidir; lökometilen mavisine indirgendiğinde ise neredeyse renksizdir. Taze süt, boyanın mavi kalmasını sağlayan çözünmüş oksijen içerir. Solunum ve fermantasyon yapan bakteriler bu oksijeni tüketir ve indirgeyici bileşikler açığa çıkarır. Redoks potansiyeli yeterince düştüğünde boya elektron alır ve rengini kaybeder. Guelph Üniversitesinin süt mikrobiyolojisi metni de aynı sıralamayı, oksijenin uzaklaştırılması ve ardından bakteriyel metabolizma sırasında indirgeyici maddelerin oluşması şeklinde açıklar.
Journal of Dairy Science dergisindeki klasik çalışmalar bunu iki aşamalı bir süreç olarak ele alır: flora önce oksijeni tüketir, ardından süt bileşenleri boyayı hızla indirger. Bu nedenle sütte metilen mavisi indirgenme testi, bir hücre sayımı olarak değil, toplam metabolik aktiviteyi değerlendiren işlevsel bir analiz olarak anlaşılmalıdır. Metilen mavisinin redoks davranışı, bu değişimin kimyasını açıklar.
Oksijen, son noktadaki renk değişimini tersine çevirir. Havaya maruz kalan indirgenmiş löko boya yeniden yükseltgenir ve tekrar maviye döner. Bu nedenle çalkalama, dökme, geniş tüpler ve tüpte sıvının üzerinde geniş bir hava boşluğu bulunması sonucu geciktirir. Tüp içindeki sıvının ana kısmı renksizleştikten sonra hava ile temas eden yüzeyde ince bir mavi halka sıklıkla kalır. Standart prosedürler, bu halkanın kaybolmasını beklemek yerine varlığını kabul eder.
Organizma türü, sonuçta ikinci bir sapmaya yol açar. Koliformlar ve birçok laktik asit mikroorganizması boyayı hızla indirger. Birçok psikrotrof ve ısıya dayanıklı mikroorganizma ise boyayı yavaş indirger veya neredeyse hiç indirgemez. Plak sayımı sonucu aynı olan iki süt numunesinde mavi renk, saatler arayla kaybolabilir. Bu gerçek tek başına, sürenin koloni sayısına dönüştürülemeyeceğini gösterir.
Kontrollü bir laboratuvar prosedürü
Saha uygulamaları ile ders kitaplarındaki yöntemler ayrıntılarda farklılık gösterir. Bu nedenle bir sonuç yalnızca elde edildiği yöntem kapsamında geçerlidir. Geleneksel bir gıda laboratuvarı uygulaması şu şekilde yürütülür:
- Çiğ sütü mümkün olduğunca az havalandırarak alın ve hemen soğutun. Numune almadan önce kabı nazikçe ters çevirerek karıştırın.
- Steril bir tüpe 10 mL süt ve 1 mL çalışma boya çözeltisi koyun. Yaygın kullanılan çalışma konsantrasyonlarından biri yüzde 0.005 boyadır; süt ile boya oranı 10'a 1'dir.
- Tüpü tıpayla kapatın, iki kez nazikçe ters çevirin ve birkaç dakika içinde su banyosuna yerleştirin. Tipik inkübasyon sıcaklığı, uygulanan standarda bağlı olarak 35 ile 38 santigrat derece arasındadır. Hangi standardı izlediğinizi kaydedin.
- Işık indirgenmeyi hızlandırdığı için inkübasyon sırasında tüpleri ışıktan koruyun.
- İlk değerlendirmeyi 30 dakikada, sonraki değerlendirmeleri sabit aralıklarla yapın. Son nokta, tüpün kaynatılmış süt referansıyla aynı görünümü aldığı veya prosedürde tanımlanan renk kaybına ulaştığı zamandır.
- Yöntem gerektiriyorsa aynı sütten alınmış, işlem uygulanmamış bir tüpü görsel kontrol olarak tutun.
FAO'nun süt testleri el kitabı, bu sıralamanın açık bir saha uygulamasını verir: 10 mL süte 1 mL boya eklenmesi, tüpün tıpayla kapatılması, nazikçe ters çevrilmesi, yaklaşık 37 ile 38 derecede inkübasyon ve her 30 dakikada bir değerlendirme. Kontrol tüplerinde, doğal indirgeme sistemini ortadan kaldırmak ve renk karşılaştırmasına referans sağlamak için kaynatılmış süt kullanılır.
Yukarıdaki şema, kontrol edilmesi gereken koşulları gösterir. Aynı hacimler, aynı boya, aynı sıcaklık, aynı karıştırma, aynı ışık koruması, aynı son nokta kuralı. Bunlardan herhangi biri değiştiğinde ölçülen süre de değişir. Bu nedenle rastgele bir boya konsantrasyonu kullanılan ev uygulamaları, laboratuvar sınıflandırmalarıyla karşılaştırılamaz.
İndirgenme süresi neyi gösterir?
Daha uzun süre, belirtilen koşullar altında daha düşük toplam aktivite anlamına gelir. Daha kısa süre ise daha yüksek toplam aktivite anlamına gelir. Sütçülük eğitiminde kullanılan tablolar bu sürelere yaklaşık kalite sınıfları atar. Örneğin BIS'ten türetilmiş bir sınıflandırmada 5 saat veya daha uzun süre çok iyi, 30 dakikanın altındaki süre ise kötü olarak değerlendirilir.
Buradan çıkarılacak ders, sınıflandırmaların değişkenliğidir. 5 saatlik bir sonucun evrensel bir kalite sınıfı yoktur. Sonuç, onu tanımlayan prosedüre aittir. Bu nedenle bilimsel olarak savunulabilir raporlama biçimi şöyledir:
MBRT, belirtilen yöntem altında X saattir ve o yöntemin ilgili kalite sınıfına karşılık gelir.
Sonuç hiçbir zaman MBRT, mL başına X koloni oluşturan birime eşittir şeklinde verilmez. Standard Methods'tan türetilen rehberler, boya indirgenmesi sonuçlarının bakteri sayısı olarak raporlanmaması gerektiğini belirtir. Metilen mavisiyle basit boyama prosedürü de farklı bir soruya yanıt verir; tüpteki toplam aktivite yerine mikroskop altında hücre şeklini gösterir.
Yorumlama ve sınırlamalar tablosu
Bu tablo, makalenin özgün başvuru tablosudur. Her satırı tüm sütunlarıyla birlikte okuyun. Hiçbir hücre tek başına değerlendirilmemelidir.
| Gözlem veya iddia | Neyi gösterir? | Neyi kanıtlayamaz? | Sonucu etkileyen başlıca faktörler |
|---|---|---|---|
| Mavi rengin hızla kaybolması; bir çiğ süt sınıflandırmasında 2 saatin altında | Yüksek mikrobiyal yük veya düşük saklama kalitesiyle uyumlu, yüksek indirgeme aktivitesi | Tür, kesin sayı, toksinler veya pastörizasyon başarısızlığı | Sıcak ortamda saklama, koliform bakımından zengin flora, ışık, düşük boya miktarı |
| Orta düzey süre, 2 ile 4 saat | Orta düzey aktivite; kalite sınıfı yalnızca belirtilen sınıflandırma kapsamında geçerlidir | Güvenlik veya yavaş indirgeyen mikroorganizmaların bulunmadığı | Yüksek inkübasyon sıcaklığı, havalandırma farklılıkları, yağın ayrılması |
| Yavaş indirgenme, 5 saat veya daha uzun | İlgili sınıflandırmada düşük toplam aktivite | Patojenlerin bulunmadığı, pastörizasyonun gerçekleştiği veya kimyasal güvenlik | Antibiyotik kalıntıları, koruyucular, fazladan çözünmüş oksijen, yüksek boya miktarı |
| Sıvının ana kısmı renksizleşirken yüzeyde mavi halkanın kalması | Hava ile temas yüzeyinde yeniden yükseltgenme; normal bir sınır yüzeyi etkisi | Testin başarısız olduğu veya reaksiyonun tamamlanmadığı | Geniş tüp, gevşek tıpa, incelemek için tüpün tekrar tekrar açılması |
| Isıtılmış sütün inkübasyonundan sonra beyaz tüp | Değişmiş indirgeme sistemi ve canlı kalan mikroorganizmaların aktivitesi | Isıtmanın doğrulanmış pastörizasyona eşdeğer olduğu | Isı hasarı, inkübasyon sırasında onarım, sonradan kontaminasyon |
| Yöntem belirtilmeden aktarılan herhangi bir tek MBRT değeri | Test koşullarının bilinmediği | Herhangi bir kalite sınıfı veya sayı | Boya formülasyonu, oran, sıcaklık, karıştırma ve son nokta kuralının hiçbirinin raporlanmamış olması |
Bakteriyel kültür besiyerleri gibi üremeye dayalı kontroller, sayım ve izolasyon için kullanılmaya devam eder. İndirgenme tüpü tarama yapar. Kültür plağı tanımlama ve sayım sağlar.
Test güvenlik hakkında neyi kanıtlayamaz?
Yavaş indirgenme, patojenlerin bulunmadığını kanıtlayamaz. Klinik açıdan önem taşıyan miktarda bulunan bir patojen, toplam oksijen tüketimine çok az katkıda bulunabilir. Patojen tespiti, organizmaya özgü yöntemlerle yapılır. Güncel Standard Methods, bunları genel kalite taramasından ayrı bir alan olarak ele alır.
Test pastörizasyonu doğrulayamaz. Codex'in süt ürünleri hijyeni rehberine göre ısıl işlemin doğrulanmasında alkalen fosfataz testi veya başka bir doğrulanmış yöntem kullanılır. Beyaz veya mavi bir tüp, partinin süre ve sıcaklık geçmişi hakkında hiçbir şey söylemez.
Test gıda güvenliğini onaylayamaz. Güvenlik; patojenlere, önceden oluşmuş toksinlere, ilaç kalıntılarına, kimyasal kirleticilere, soğuk zincir geçmişine ve numune alımından sonraki kontaminasyona bağlıdır. Codex, süt ürünlerinin güvenliğini tek bir tarama sonucu olarak değil, bir kontrol önlemleri zinciri olarak ele alır.
Gıda laboratuvarı koşulları ile evde test yapma koşulları farklıdır
Bir süt ürünleri laboratuvarında bu test, kabul edilen sütü taramak, tedarikçileri zaman içinde karşılaştırmak veya gözetim altında redoks mikrobiyolojisini öğretmek için kullanılır. Numuneler izlenebilirdir. Reaktifler standartlaştırılmıştır. Sıcaklıklar kaydedilir. Atıklar laboratuvarın atık bertaraf sürecine gider.
Evde yapılan testlerde bu koşulların hiçbiri sağlanmaz. Mutfakta ölçülen hacimler yaklaşık değerlerdir. İnternette satılan boyaların konsantrasyonları büyük ölçüde değişir. İnkübasyon çoğunlukla kalibre edilmiş bir su banyosu yerine sıcak bir odada yapılır. Renk değişimi yine de gerçekleşir. Sonuca anlam kazandıran tüm kontroller eksik olmasına rağmen bu durum sonucu güvenilir hissettirir.
Daha belirgin risk, davranış üzerindeki etkisidir. Evde mavi kalan bir tüp, bir laboratuvarın hâlâ plak sayımı, patojen taraması ve kalıntı kontrollerine göndereceği çiğ sütü içmeye yöneltir. Sütte metilen mavisi testi, çiğ süt kabulünde kalite sınıflandırması yapmak için tasarlanmıştır; sütü tüketime uygun ilan etmek için değil. Daha hızlı rezazurin taramasının sınırı da aynıdır: renk daha hızlı değerlendirilir, ancak yine patojenlere ilişkin bir yanıt vermez.
Laboratuvar tezgâhı için kısa bir kural
Boyayı, oranı, sıcaklığı, karıştırmayı, ışığı ve son noktayı standartlaştırın. Süreyi, yöntem adı ve kalite sınıfıyla birlikte raporlayın. Süreyi; saklama geçmişi, flora türü, kalıntılar ve numune alma kalitesiyle birlikte yorumlayın. Kısa bir süre, araştırılması gereken aktiviteye işaret eder. Uzun bir süre ise güvenliği hiçbir zaman onaylamaz.