Mor kan boyasını kim geliştirdi? Metilen mavisi, Malachowski, Romanowsky ve Giemsa

Eozin kırmızıdır. Metilen mavisi mavidir. İkisini karıştırıp karışımı kurutulmuş bir kan yaymasına uyguladığınızda, yaymanın bazı kısımları mor görünür.

Her kısmı değil. İyi bir preparatta akyuvarların çekirdekleri kırmızı-mor renk alır; sıtma parazitinin içindeki kromatin de aynı renge boyanırken çevredeki alyuvarlar pembe, sitoplazma ise gri-mavi kalır. Hücre türlerinin birbirinden ayırt edilmesini sağlayan bu mor renktir.

İki şişenin hiçbirinde mor yoktur. Renk, ancak metilen mavisinin belirli bir bozunma ürünü lam üzerinde eozinle karşılaştığında ortaya çıkar. 1880'lerde ve 1890'larda kimse bu ürünün ne olduğunu bilmek bir yana, varlığından bile haberdar değildi. Rengin peşine düşenler, saf olmayan boyalarla tek başlarına çalışıyordu. Bir şişe iki ay rafta bekledikten sonra içinde ne olduğunu güvenilir biçimde belirleyebilecekleri bir yöntem yoktu.

Başlıktaki sorunun birden fazla savunulabilir yanıtı olmasının ve yanıtın 2011'de değişmesinin nedeni budur.

Karışımla birlikte değişen gözlem olanakları

Bu boyama yöntemi tek seferde icat edilmedi. Katkılar birikerek oluştu. Karışımda yapılan her değişiklik, gözle görülebilen tam bir yeni bilgi sağladı. Bu bilgilerin sıralanışı, tarihi anlamanın en açık yoludur.

Önemli olan, son sütunda görülen örüntüdür. Her ilerleme renk aralığını genişletti ve her genişleme bir yapıyı daha görünür kıldı. Mor renk, tekniğe eklenmiş bir süs değildir; bir parazitin varlığını görmekle hangi yapılardan oluştuğunu görmek arasındaki farktır. Boyanın bir BASF boya fabrikasından çıkıp tıbba nasıl ulaştığı, kendi belgeleri olan daha uzun bir tarihin konusudur. Yukarıdaki sıralamanın tamamı, her kaydın dayandığı kaynakla birlikte, kaynak bağlantılı katkı sahipleri zaman çizelgesinde tutulmaktadır.

Şekil: aynı altı karışımın kaptaki içerik ve ortaya çıkan sonuç açısından gösterimi. Çemberler boyaları, altlarındaki bloklar ise bu boyaların bir kan yaymasında oluşturabildiği renkleri gösterir. 1890'dan önce hiçbir karışımda kırmızı-mor blok yoktur; sonrasında ise hepsinde vardır.

Boraksı bilinçli olarak kullanan kişi

Ernst Malachowski, bugünkü adı Wrocław olan Breslau'da yaşayan bir hekimdi. Meslek yaşamını özel muayenehanesinde ve bir meslektaşıyla birlikte işlettiği küçük bir klinikte geçirdi; laboratuvar çalışmalarını kendi zamanında yürüttü. 12 Mart 1857'de Strzelno'da doğdu, Breslau Üniversitesinde tıp eğitimi aldı ve 1882'den 1887'ye kadar, o dönemde Almanya'nın ikinci büyük hastanesi olan All Saints Hastanesinde iç hastalıkları asistanı olarak çalıştı.

1888'de Chęciński ve Plehn'in çift boyama yöntemiyle çalışmaya başladı. 1889'da hazırladığı bir preparatta, plazmodyum çekirdeğinin kromatininin sitoplazmadan farklı boyandığını gördü; ancak ardından bu sonucu tekrarlayamadı. Metilen mavisini asitleştirmeyi denedi, bu da durumu kötüleştirdi. Boraksla alkali hâle getirmeyi denediğinde ise yöntem her seferinde işe yaradı. Yöntemi 15 Haziran 1890'da kamuya açık olarak gösterdi ve Ağustos 1891'de, boraks kullanımına ilişkin talimatı da içeren daha ayrıntılı bir açıklama yayımladı. Boyamanın yirmi dört saat sürdüğünü ve sonuçların kolayca tekrarlanabildiğini belirtti.

Yirmi dört saat, bir tanı laboratuvarı için uzun bir süredir. Ayrıca makalesinde parazit çekirdeğinin mor-kırmızı rengi üzerinde fazla durmadı. Nedeni ne olursa olsun, Nocht 1898'de aynı işlemi yeniden yapana kadar kimse metilen mavisini bilinçli olarak alkali hâle getirme yöntemini benimsemedi. Malachowski bir daha kan boyaması hakkında yazmadı.

Yakın zamana kadar hakkında bu kadar az şey bilinmesinin nedeni gizemli değildir; arşivlerle ilgilidir. Yaşamına dair tıp literatüründe neredeyse hiçbir iz kalmamıştı ve günümüze ulaşanlar tek bir yoldan geldi. Kızı Marie, 1939'da Almanya'dan Londra'ya gitti, Britanya Ordusunda görev yaptı ve Kanada'ya yerleşti. Topladığı aile belgeleri sonunda New York'taki Leo Baeck Enstitüsüne ulaştı. Erkek kardeşi Leo, Birinci Dünya Savaşı'nda öldürüldü. Kız kardeşi Eva, Nisan 1942'de Breslau'dan Izbica geçiş kampına sürüldü ve bir daha dönmedi. Annesi Hedwig, aynı sürgünü beklemek yerine 22 Nisan 1942'de yaşamına son verdi. Malachowski ise tüm bunlardan önce, 1934'te ölmüştü.

Böyle sona eren bir aile tarihi, atıf yapılması da sona eren bir aile tarihidir. Malachowski'yi boyanın gelişim tarihine yeniden dâhil eden ve her ikisi de 2011'de yayımlanan iki makale, Poznań ve Wrocław'daki arşiv belgeleri ile Marie'nin New York'taki belgelerinden yararlanılarak hazırlandı.

Küflü bir şişe ve şanslı bir Rus

Dmitri Romanowsky, St Petersburg'daki Askerî Tıp Akademisinde tıp eğitimi aldı ve meslek yaşamının büyük bölümünde sıtma üzerine çalıştı. 1890'da, kâğıt üzerinde Chęciński'ninkiyle neredeyse aynı olan bir yöntem yayımladı: değiştirilmemiş metilen mavisi ve eozin; yalnızca eozin miktarı biraz daha fazlaydı.

Eylül 1891'de, adını duyuran yöntemi yayımladı. Belirleyici ayrıntı ise talimatların içinde kalmıştı. En iyi sonuçları, iki aydan uzun süre beklemiş ve üzerinde küf gelişmiş bir metilen mavisi stok çözeltisinden elde etmişti. Küf ve bekleme süresi, boyayı kısmen demetile etmişti. Romanowsky bunu bilmiyordu ve kontrol edemiyordu; yöntemini deneyen başka araştırmacılar da mor rengi elde edemiyordu. Tezini Haziran 1891'de St Petersburg'da sunmuştu. Yaygın tarih anlatısının keşif yılı olarak 1891'i kabul etmesinin nedeni budur.

Malachowski'nin gösterimi ise bir yıldan daha önce, Haziran 1890'da yapılmıştı ve onun yöntemi bilinçli bir işlem sayesinde işe yarıyordu.

Boyaya neden yanlış kişinin adı verildi?

Malachowski lehindeki değerlendirmeyi Kristine Krafts, Ernst Hempelmann ve Barbara Oleksyn hazırladı. Bu değerlendirme dört noktaya dayanır. Kamuya açık gösterimin tarihi: Eylül 1891'e karşı Haziran 1890. Tesadüfi sözcüğüne karşı bilinçli sözcüğü. Malachowski'nin boraks kullanımı da dâhil olmak üzere yöntemini yayımlamış olması; Romanowsky'nin yönteminin ise kontrol edilmeyen bir değişkene dayanması. Son olarak, plazmodyum çekirdeğinin tanımının ve onu görünür kılan mor rengin, tesadüfen elde edilen sonucu kimse tekrarlayamadığı için yedi yıl boyunca literatürden fiilen kaybolmuş olması.

Vardıkları sonucu açıkça ifade ederler. Biyografi makalesinde bu atfı “bir çarpıtma” olarak nitelerler ve Ralph Lillie'nin 1978'de yazdığı şu ifadeyi aktarırlar: “Belki de bu boya ailesinden Malachowski boyaları olarak söz etmeliyiz.”

Öncelik iddialarında genellikle olduğu gibi bu iddia da tartışmalıdır. Tartışmayı sonuçlandırmaya çalışmaktan ziyade, neyin tartışıldığını açıklamak gerekir. Öncelik üzerine bir sav, keşfin ne olduğunu tanımlamak zorundadır. Keşif mor renkse, daha erken tarihli belgelenmiş gösterim Malachowski'ye aittir. Keşif yayımlanan yöntemse, her ikisi de 1891'de yayımlamıştır ve boyaya Romanowsky'nin adı verilmiştir. Keşif açıklamaysa, ikisinin de böyle bir iddiası olamaz; çünkü hiçbiri olgunlaşmanın demetilasyon olduğunu bilmiyordu ve hiçbiri rengin neden ortaya çıktığını açıklayamıyordu. Popüler anlatıların atladığı nokta budur. Etkin bileşen, kimsenin tanımlamadığı bir safsızlıktı. Rengi bilinçli olarak ilk elde eden kişi, bunu tarifin ne yaptığını anlayarak değil, tekrarlanabilir ampirik bir tarifle başarmıştı.

2011'deki iki makale, Malachowski lehindeki değerlendirmenin yayımlanmış en kapsamlı ifadesidir. Her ikisi de PubMed üzerinden ücretsiz okunabilir: kapsamlı derleme PMID 21235291 ve biyografi makalesi PMID 21660627. Derlemenin PubMed kaydı, aynı yıl daha sonra aynı dergide 86(5):366'da yayımlanan bir yorumu da listeler. Bu, savın yayımlanır yayımlanmaz basılı literatürde tartışmaya açıldığını hatırlatır.

Bu anlaşmazlık kimyayla ilgili değildir. Tartışmaya katılan herkes, mor rengin ne olduğu ve hangi bileşenlerin onu oluşturduğu konusunda hemfikirdir. Anlaşmazlık, bunu ilk kimin başardığı ve kimsenin tekrarlayamadığı bir tesadüfün başarı sayılıp sayılamayacağı üzerinedir.

Sonraki isimlerin sağladığı katkılar

Mor rengi ilk Malachowski elde ettiyse, boya neden Romanowsky, Wright ve Giemsa'nın adlarını taşıyor?

Çünkü mucidinin elinde bir kez işe yarayan bir boya, reaktif sayılmaz. Sonraki çalışmalar, değişken davranan bir karışımı başka bir ülkedeki teknisyenin sıradan bir salı günü kullanabileceği bir ürüne dönüştürdü.

Nocht bu sonuca akıl yürüterek ulaştı. Basit bir nötr boyayla güvenilir bir sonuç elde edemeyince, mor rengin metilen mavisinin içinde bulunan ama metilen mavisi olmayan bir maddeden kaynaklanması gerektiği sonucuna vardı ve onu aramaya başladı. Unna, beklemiş metilen mavisi çözeltilerinin mast hücresi granüllerini kırmızıya boyadığını daha önce fark etmiş ve boya olgunlaşırken yeni bir madde oluştuğunu öne sürmüştü. Bernthsen, 1885'te alkali koşulların metilen mavisinden metil gruplarını kopardığını ve bu ürünlerin bugün azürler dediğimiz maddeler olduğunu göstermişti. Nocht etkin fraksiyonu kloroformla ekstrakte etti ve ona yalnızca metilen mavisinden elde edilen kırmızı diyebildi; Michaelis 1901'de bu maddeye azür I adını verdi. Jenner, hazırlama ve kullanım sorununu çözdü. Metilen mavisi ve eozin çökeltisinin mutlak metanolde yeniden çözülmesi, yaymayı boyarken aynı zamanda fikse eden tek bir kararlı çözelti sağladı ve ısıyla fiksasyona son verdi. Leishman ve Reuter, polikromlaştırılmış boyayı alkollü bir çözücüyle birleştirerek hem kararlılığı hem de mor rengi elde etti. Wright, 65 °C'de on iki saatlik inkübasyon ve on günlük bekletme yerine, akan buhar altında bir saatlik işlem kullandı. Giemsa, rastgele olgunlaşmış bir çözeltiye dayanmayı tamamen bıraktı; ürünün tropikal sıcağa dayanabilmesi için metanolün içinde gliserolle birlikte, bilinen boyaları ölçülü miktarlarda kullandı. Saf metilen azürü nasıl elde ettiğini hiçbir zaman yayımlamadı. Onu Leipzig'deki Dr Grübler laboratuvarına sattı. Laboratuvar ürünü azür I adıyla pazarladı ve yalnızca kendi ürününün gerçek Giemsa boyası olduğunu iddia etti.

Bu azürün kimliği hâlâ tartışılmaktadır. Bazıları onun yalnızca polikromlaştırılmış metilen mavisi olduğunu, diğerleri ise Azure B bakımından zengin olduğunu savunur. Yanıt bir savaş sırasında ortaya çıktı. Alman boyaları temin edilemez hâle geldiğinde, Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisinden Ralph Lillie, Maurice Roe ve Aimee Wilcox'un oluşturduğu ekip, en iyi boyamanın ayrılmış üç bileşenle elde edildiğini buldu: değiştirilmemiş metilen mavisi, onun demetilasyon sonucu oluşan bozunma ürünü Azure B ve eozin. Temin edilemeyen azür I'in yerini Azure B aldı. Bu üç bileşen, günümüzde sıtma tanısında kullanılan boyanın temelini oluşturmaya devam ediyor.

Bu üç bileşenin lam üzerinde nasıl etkileştiğinin kimyası, ayrı bir sorunun ve başka bir sayfanın konusudur. Romanowsky tipi boyalarda boyaların rolleri ve kimyası sayfası, Azure B ile eozinin ayrı ayrı ne yaptığını ve bu ikilinin neden tek başlarına oluşturamadıkları bir renk ürettiğini ele alır. Mikroskopi ve laboratuvar uygulamaları sayfası ise uygulamaya odaklanır: belirli bir preparatın ne gösterdiğini ve belirli bir ürünün kullanmayı planladığınız yönteme uygun olup olmadığını nasıl değerlendirebileceğinizi açıklar.

Tarihin hâlâ güncel olan kısmı

Bu öyküdeki bir ayrıntı, 1902'den sonra da geçerliliğini korudu. Yaklaşık elli yıl boyunca, dünyanın standart sıtma boyasının en önemli bileşeni, adı konmamış bir safsızlıktı. Karışımda tesadüfen bulunuyordu, miktarı şişeden şişeye değişiyordu, bu sürenin bir bölümünde kimliği ticari sırdı ve oranı 1940'lara kadar tartışıldı. Boyayı kullananlar özensiz değildi. Şişenin içinde ne olduğunu bilmelerini sağlayacak bir yöntemleri yoktu.

Aynı sorunun günümüzdeki karşılığı, malzemenin yalnızca bir kısmını tanımlayan bir spesifikasyondur. USP'ye uygunluk, piyasada sunulan en yüksek saflığa ulaşmanın yoludur; çünkü tek bir ölçüm değil, yayımlanmış eksiksiz bir standarttır: kimlik, saflık, azür boyaları da dâhil organik safsızlıklar, kalıntı çözücüler, elementel safsızlıklar, yakma kalıntısı, mikrobiyal sınırlar ve bakteriyel endotoksinler. Blupreme, metilen mavisini bir ilaç üreticisinden temin eder ve tam analiz sertifikasını yayımlar. Böylece bu listedeki her madde yalnızca beyan edilmekle kalmaz, kontrol edilebilir. Bir ağır metal sonucunu bildirip bunu USP uygunluğu olarak adlandıran bir sertifika, üzerinde “olgunlaştırılmış metilen mavisi” yazan bir şişenin günümüzdeki karşılığıdır: iyi bir reaktif olabilir, ancak etiket içinde ne olduğunu söylemez.