Metilen mavisiyle maya testleri: canlı hücre sayımı ve solunum süresinin ölçülmesi

Laboratuvar tezgâhında iki tüp duruyor. İkisi de mavi. Birinde, mikroskop altında görülen mavi hücreler ölü maya anlamına geliyor. Diğerinde ise maviden renksize dönen bir tüp, mayanın canlı olduğunu ve solunum yaptığını gösteriyor. Aynı boya, zıt yorumlar. Bu iki testi birbirine karıştırırsanız tüm sonuçların anlamı tersine döner.

Bu ayrım, makalenin temel konusudur. Metilen mavisi bir redoks boyasıdır: yükseltgenmiş hâli mavi, indirgenmiş hâli ise renksiz lökometilen mavisidir. Canlılık sayımı, bu kimyadan kısa süreli bir mikroskobik gözlemde yararlanır. Solunum deneyi ise aynı kimyadan, tüm karışımda gerçekleşen ve süresi ölçülen bir tepkimede yararlanır. Her biri kendi protokolünü, kendi kontrollerini ve kendi sorgulayıcı yaklaşımını gerektirir.

Canlılık sayımı: kısa süreli boyayın, gecikmeden değerlendirin

Bira üretiminde kullanılan protokol, en fazla standardize edilmiş uygulamadır. 2% sodyum sitrat içinde 0.01% w/v metilen mavisi hazırlayın, maya süspansiyonuyla 1:1 oranında karıştırın ve karışımı kısa, sabit bir sürenin ardından inceleyin. Yayımlanmış bekleme süreleri, Brewing Science Institute el kitabındaki 1 ile 2 dakika arasında değişen sürelerden araştırma protokollerindeki yaklaşık 5 dakikaya kadar uzanır; OIV şarap mikrobiyolojisi yöntemi ise incelemenin 10 dakika içinde yapılmasını gerektirir. Sayım karışımındaki son boya derişimi yaklaşık 0.005% olur. Geliştirilmiş bir Neubauer sayım kamarasını doldurun ve yaklaşık 400x büyütmede koyu mavi hücreleri canlı olmayan, boyanmamış hücreleri ise canlı olarak sınıflandırın. OIV yönteminde açık mavi hücreler canlı olarak değerlendirilir; bu da aşağıda ele alınan öznellik sorununa şimdiden işaret eder.

Hücre derişimi, sayım kamarasının geometrisinden hesaplanır. Ortadaki 1 mm kenarlı karenin tamamı sayıldığında, mL başına hücre sayısı N ile seyreltme faktörünün ve 10^4 değerinin çarpımına eşittir. Burada N, ASBC maya yöntemlerinde belirtildiği gibi, bu alanda sayılan hücre sayısıdır. Canlılık hesabı daha basittir: boyanmamış hücre sayısı toplam hücre sayısına bölünür ve 100 ile çarpılır. FEMS bira üretimi karşılaştırma çalışmasını ve OIV uygulamasını izleyerek, canlılık tahmini için yaklaşık 400 hücre sayın. Tek bir sınır kuralını tutarlı biçimde uygulayın; örneğin alt ve sol ızgara çizgilerindeki hücreleri sayıma katın, üst ve sağ çizgilerdekileri dışarıda bırakın.

Sayım başlamadan önce tomurcuklar için bir kural belirlenmelidir. Yaygın bir uygulamada, tomurcuk ana hücrenin yaklaşık yarısı büyüklüğüne ulaştığında ayrı bir hücre olarak sayılır; daha küçükse ana hücreyle birlikte sayılır. Hangi kural seçilirse seçilsin, her kareye uygulayın ve sonraki kişinin aynı şekilde sayabilmesi için sayım formuna yazın.

Sayım formu (bunu yazdırın)

Bu form, bu makale için hazırlanmış özgün bir materyaldir. Bir deftere kopyalayın veya her numune için bir tane yazdırın.

Canlılık (%) = 100 x boyanmamış / (boyanmamış + koyu mavi). mL başına toplam hücre sayısı = N x seyreltme faktörü x 10^4; burada N, tanımlanmış sayım kamarası alanından elde edilir. Boyama süresini sonucun yanına kaydedin; çünkü ölçüm zamanı belirtilmeyen bir canlılık değeri tekrarlanabilir değildir.

Canlılık değerleri neden değişir?

İlk etkileyen etken zamanlamadır ve iki yönde de hataya neden olabilir. Metabolik olarak aktif hücreler boyayı indirger; bu nedenle erken değerlendirme, canlı hücreleri indirgeme tamamlanmadan yakalayıp yanlışlıkla ölü olarak sınıflandırabilir. Ancak uzun süreli maruz kalma da toksiktir ve gerçekten hasar görmüş mavi hücreler oluşturur; böylece boyama, başlangıçtaki hücre ölümünü olduğundan fazla gösterir. Bu nedenle bir laboratuvar eğitim protokolü, Wisconsin maya eğitim protokolünde belgelendiği gibi, değerlendirmenin 5 dakika içinde yapılmasını belirtir. Güvenilir ifade şudur: metilen mavisiyle değerlendirme zamana bağlıdır; bu yüzden kısa bir süre belirleyin ve bir serideki tüm numunelerde bu süreyi sabit tutun.

Canlılığı düşük numuneler ikinci bir yanlılık kaynağıdır. Standardize edilmiş yöntem, yaklaşık 80% değerinin altında metilen mavisinin gerçek canlılığı olduğundan yüksek gösterebileceği konusunda uyarır; çünkü boyayı hâlâ indirgeyebilen hücreler üreme yeteneklerini korumamış olabilir. Bira üretimi literatürü de canlılık önemli ölçüde azaldığında aynı güvenilirlik sorununu tanımlar. Metilen mavisini hızlı ve yaklaşık bir tahmin yöntemi olarak kullanın; bir kültürü yeniden mayalamada kullanmak gibi düşük canlılıkla ilgili kritik kararları, plak sayımı veya tamamlayıcı bir boyama yöntemiyle doğrulayın.

Üçüncü sırada matriks etkileri gelir. OIV yöntemi yaklaşık pH 4.6 düzeyinde uygulanır ve güçlü biçimde tamponlanmış düşük pH'lı numunelerin boyanın doğru davranmasını engellediği konusunda uyarır. Ayrıca hücrelerin yanıltıcı biçimde açık mavi göründüğü 100 g/L üzerindeki şeker derişimlerinde testin kullanılmamasını önerir. Boyama pH'ını karşılaştıran bir deneyde, test edilen aralık boyunca duyarlılığın önemli ölçüde değiştiği bulunmuştur; bu bulgu, pH'a bağlı metilen mavisi yöntemi çalışmasıyla uyumludur. Kalıntılar ayrı bir hata kaynağıdır: çok miktarda kalıntı içeren mayşelerde boyanan parçacıklar ölü hücrelere benzer ve uygulayıcılar arasındaki değişkenliği artırır.

Bu değişkenlik, tekil gözlemlere dayanmaz; nicel olarak ölçülmüştür. FEMS maya karşılaştırmasında bildirilen altı aylık bir bira üretim tesisi çalışmasında, ikili metilen mavisi ölçümlerinin ortalama standart sapması 6.1% iken oksanol akış sitometrisinde bu değer 0.2% olmuştur. Aynı numunede iki uygulayıcının sonuçları arasında 13 yüzde puanına kadar fark görülmüştür. Canlılık yöntemlerinin 2023 tarihli nicel karşılaştırması, floresans mikroskopisi ve akış sitometrisinin belirgin biçimde daha yüksek kesinlik sağladığını bulmuş, performansın tür ve matrikse bağlı olduğunu da göstermiştir. Painting ve Kirsop'un (PMID 24430080) klasik yöntem açıklaması temel başvuru kaynağı olmaya devam eder. Daha kapsamlı bir maya canlılığı ve metabolik etkinlik testleri derlemesi (PMID 25154541) ise metilen mavisini kesin sonuç veren testlerden çok, tamamlayıcı testler arasında konumlandırır. Tripan mavisi bu durumda kendiliğinden daha iyi bir seçenek değildir: zar bütünlüğünün kaybını gösterirken metilen mavisi, boyanın hücreye alınmasını ve indirgeme etkinliğini gösterir. Bu nedenle stres altındaki hücreler, iki boyayla farklı sınıflandırılabilir.

Solunum deneyi: mavi rengin kaybolma süresini ölçün

İkinci testte mikroskop kullanılmaz. Maya, glikoz ve seyreltik metilen mavisi kapalı bir tüpe konur; kronometre, mavi rengin kaybolmasının ne kadar sürdüğünü ölçer. Hücreler metabolik faaliyetlerini sürdürürken mavi boyayı renksiz biçimine dönüştüren indirgeme eşdeğerleri üretir; çözünmüş oksijen ise boyayı yeniden yükseltger. Hücreler oksijen düzeyini düşürdüğünde net indirgenme baskın hâle gelir ve tüp renksizleşir. Bu nedenle son nokta; solunum, boya derişimi ve oksijen mevcudiyeti arasındaki dengeyi yansıtır. Sonuç, doğrudan moleküler oksijen tüketim hızı olarak değil, metilen mavisinin indirgenme veya renk giderme süresi olarak raporlanmalıdır.

Ölçülecek sürenin uygun bir aralıkta kalması için canlılık çalışmalarındakinden çok daha seyreltik boya kullanın. AQA A level zorunlu uygulamalar el kitabı bunu ayrıntılı biçimde standardize eder: yaklaşık 30 C'ye ısıtılmış 100 mL su başına 1 g glikoz, kullanımdan hemen önce eklenen 5 g kuru maya ve 1% stok çözeltiden alınan 0.1 mL'nin 100 mL'ye seyreltilmesiyle hazırlanan, yaklaşık 0.001% derişimindeki çalışma boyası. 2 mL maya ve glikoz süspansiyonunu 2 mL çalışma boyasıyla karıştırın, test sıcaklığında dengeye gelmesini sağlayın, bir kez 10 saniye çalkalayın, kronometreyi başlatın ve tekrar çalkalamayın. Çalkalama, karışıma yeniden oksijen katar ve tüpün tekrar maviye dönmesine neden olur; bu, işlemin yol açtığı en büyük artefakttır. AQA, hazırlanan karışımın 35 C'de normal olarak yaklaşık 5 dakika içinde renksizleşmesi gerektiğini belirtir; deneme ortalamaları 20 C'de 275 s, 35 C'de 128 s ve 45 C'de 145 s olmuştur. Bunlar tek bir düzenekten alınan örneklerdir, evrensel karşılaştırma ölçütleri değildir. Kontrollü koşullarda indirgenme hızı ile metabolik olarak aktif maya arasındaki nicel ilişki, PMID 25773544 olarak indekslenen çalışma ve Yeast (2014) dergisindeki mekanizma çalışması dâhil, bu konuya odaklanan indirgenme çalışmalarıyla desteklenir.

Zamana bağlı değişim örneği (özgün materyal)

Aşağıdaki tablo, yukarıda açıklanan AQA tarzı düzenek kullanılarak bu makale için hazırlanmış özgün bir gösterimdir: 2 mL maya ve glikoz karışımına yaklaşık 0.001% derişimindeki çalışma boyasından 2 mL eklenir, bir kez 10 saniye çalkalanır ve ardından hareket ettirilmeden inkübe edilir. Kayıtlar, bir öğrenci grubunun kullanması gereken biçimde sunulmuş örnek ölçümlerdir. Hız indeksi, 1'in saniye cinsinden renk giderme süresine bölünmesiyle tanımlanır. Aynı tüplerle deneyi yapın ve bu kayıtları ölçtüğünüz değerlerle değiştirin.

A, B ve C tüpleri için hız indeksini sıcaklığa karşı grafiğe geçirin. Eğri önce yükselir, ardından yataylaşır veya düşer; bu, enzimlerin yön verdiği süreçlerde beklenen davranıştır, düz bir çizgi değildir. D, E ve F tüpleri bu eğrideki veri noktaları değildir. Bunlar, eğriyi yorumlanabilir kılan kontrollerdir.

Her testi anlamlı kılan kontroller

Her solunum deneyi, üç ek kontrol gerektirir. Kaynatılmış veya öldürülmüş maya, glikoz ve boya karışımı mavi kalmalıdır; bu, hızlı indirgenmenin canlı hücrelerin metabolizmasına bağlı olduğunu gösterir. Ek glikoz olmadan canlı maya ve boya karışımı bir substrat kontrolüdür; ancak maya hücre içi rezervlerini tükettiği için yine de yavaş bir renk giderme bekleyin. Maya içermeyen glikoz ve boya karışımı kimyasal kör numunedir. Bu kontrol zorunludur; çünkü alkali koşullarda glikoz, ortamda hiç hücre bulunmasa da metilen mavisini indirgeyebilir.

Canlılık sayımı farklı türde bir kontrol gerektirir: işlem koşullarının sabit tutulması. Aynı boya stok çözeltisi, aynı karışım oranı, aynı boyama süresi, aynı sayım kamarası alanı, aynı tomurcuk ve sınır kuralları kullanılmalı; mümkünse numune kimliği bilinmeden sayım yapılmalıdır. İki uygulayıcının sonuçları arasında on yüzde puanı fark olduğunda, sayım formu genellikle nedeni ortaya çıkarır: farklı zamanlama, mavi renk için farklı sınıflandırma eşiği veya farklı tomurcuk kuralları. Boyanmış hücreleri hazırlama ve inceleme teknikleri, basit bakteri boyama yöntemleriyle bağlantılıdır. Boyanın farklı örneklerde neleri işaretlediğine ilişkin daha geniş bir inceleme ise mikroskopi boyama atlasında yer alır. Mavi renk yoğunluğunun nicel olarak değerlendirilmesinin ardındaki fizik açısından, koşulları belirtilmiş absorpsiyon referansı, her katsayının neden çözücü, pH ve derişim koşullarıyla birlikte verilmesi gerektiğini açıklar.

Testi, soruya göre seçin. Şu anda kaç hücrenin canlı olduğu bir sayım sorusudur; mikroskop ve sayım formuyla yanıtlanır. Bu kültürün ne kadar aktif solunum yaptığı ise kinetik bir sorudur; kronometre ve koşulları kontrol edilen tüplerle yanıtlanır. Metilen mavisi her ikisi için de kullanılır, ancak aynı tüpte aynı anda kullanılmaz.