Metilen mavisi ve inflamatuvar sinyalleşme: inflamazomlar, IL-6 ve STAT3

Üç laboratuvarın aynı mavi bileşiğin antiinflamatuvar olduğunu bildirdiğini düşünün. Biri makrofajlardan daha az IL-1beta salındığını gösteriyor. Biri aynı hücre tipinde daha az iNOS enzimi bulunduğunu gösteriyor. Biri ise kanda daha az IL-6 ve beyinde daha düşük STAT3 aktivitesi olduğunu gösteriyor. Bu üç sonucu tek bir iddiada birleştirmek cazip gelebilir. Ancak bu birleştirme, bulguların özgün niteliğini gizler.

Her sonuç, kendine özgü tetikleyicisi, oluşum aşaması ve ölçülen çıktısı olan farklı bir sinyalleşme mekanizmasına aittir. Metilen mavisi her mekanizmaya farklı bir noktada etki eder. Bunlardan herhangi birinin sağlık sonuçlarını iyileştirip iyileştirmediği ayrı bir sorudur ve metilen mavisi ile inflamasyona genel bakış yazımızda ele alınır. Bu sayfa ise yolaklara odaklanır.

Yolak 1: inflamazom oluşumu ve kaspaz-1

İnflamazom, bir miyeloid hücrenin içinde gereksinim üzerine kurulan bir protein iskelesidir. Bileşenleri bir sensör, ASC adı verilen bir adaptör ve kaspaz-1 adı verilen bir efektör enzimdir. Yapı oluştuktan sonra kaspaz-1, pro-IL-1beta ve pro-IL-18'i keserek salgılanan biçimlerine dönüştürür ve inflamatuvar bir hücre ölümü biçimi olan piroptozu tetikleyebilir. Türü sensör belirler: NLRP3, kristallere ve nigerisin ile ATP gibi gözenek oluşturan toksinlere yanıt verir; NLRC4 bakteriyel flagelline, AIM2 sitozolik çift zincirli DNA'ya, kanonik olmayan yolak ise hücre içi lipopolisakkaride yanıt verir.

Aktivasyon iki sinyal gerektirir. Birinci sinyal hazırlık aşamasıdır: Toll benzeri bir reseptörün ligandı, NLRP3 ve pro-IL-1beta'nın NF-kB'ye bağımlı transkripsiyonunu uyararak bileşenlerin hazır bulunmasını sağlar. İkinci sinyal yapının oluşumudur: ikinci bir tetikleyici, ASC'nin oligomerleşerek benekler oluşturmasına, kaspaz-1'in kesilerek p20 fragmanına dönüşmesine ve olgun IL-1beta p17'nin salınmasına yol açar. Mitokondriyal reaktif oksijen türleri ve kristallerin hücre içine alınması, NLRP3 için ikinci sinyale katkıda bulunduğu bilinen etkenlerdir.

İnflamazomların geniş kapsamlı inhibisyonuna ilişkin 2017 makrofaj çalışması, metilen mavisini her iki sinyal aşamasında da test etti. Lipopolisakkaritle hazırlanmış fare kemik iliği makrofajlarında nigerisin, ATP ve monosodyum ürat kristallerinin her biri IL-1beta ve kaspaz-1 salınımını ve ASC beneklerinin oluşumunu tetikledi. 20 ila 200 mikromolar metilen mavisi ise hücreleri öldürmeden bu üç çıktıyı da doza bağımlı biçimde azalttı. NLRC4 için flagellin ve Salmonella, AIM2 için çift zincirli DNA ve Listeria, kanonik olmayan yolak içinse transfeksiyonla hücre içine verilen lipopolisakkarit veya canlı E. coli aynı örüntüyü gösterdi. Bileşik tek başına salınımı tetiklemedi ve kontrol plaklarında antibakteriyel etki görülmedi; dolayısıyla sonuç, konak yanıtıyla ilişkilidir.

Yolağın daha erken aşamalarında üç müdahalenin etkisi ölçüldü. Rotenonun tetiklediği mitokondriyal süperoksit metilen mavisiyle azaldı; rotenonun tetiklediği IL-1beta salınımı da buna eşlik ederek azaldı. Floresan boncukların hücre içine alınması azaldı; bu, kristal algılamasından önce fagositozun azalmasıyla uyumluydu. İki NF-kB bağlanma bölgesi içeren NLRP3 promotörünün yönettiği bir raportör, metilen mavisiyle daha düşük aktivite gösterirken bu bölgeleri içermeyen kısaltılmış bir promotör yanıt vermedi. Hücre içermeyen bir tüpte metilen mavisi, rekombinant insan kaspaz-1 aktivitesini de doğrudan azalttı. Bileşiğin yalnızca hazırlık veya yalnızca aktivasyon aşamasında eklenmesi de IL-1beta, IL-18 ve kaspaz-1 salınımını azalttı; dolayısıyla her iki aşama da etkiye dahildir.

Fare deneyleri bu seçicilikle uyumluydu. Ölümcül bir lipopolisakkarit dozu kontrol grubundaki fareleri saatler içinde öldürürken metilen mavisi sağkalımı artırdı; periton sıvısındaki IL-1beta azaldı ancak aynı sıvıdaki IL-6 azalmadı. Listeria peritoniti modelinde periton sıvısındaki IL-1beta azalırken toplam hücre sayıları değişmedi. İnsan THP-1 monositleri, dört inflamazom türünün tamamında fare makrofajlarına benzer davranış gösterdi. Bir inflamazom bulgusu, her sitokini değil, IL-1beta ve IL-18'in olgunlaşmasını açıklar. Bu nedenle mikroglia ve astrosit deneylerinde beyindeki bağışıklık hücrelerinin şekli, protein iskelesinin oluşumundan farklı bir soruya yanıt verir.

Yolak 2: NF-kB ve STAT1 bağlanması üzerinden iNOS transkripsiyonu

İndüklenebilir nitrik oksit sentaz, yani iNOS, dinlenim durumunda çok düşük düzeyde bulunur ve gereksinim üzerine transkripsiyonu gerçekleşir. Lipopolisakkarit bunu esas olarak IkB-alpha'nın yıkımı, ardından NF-kB'nin fosforilasyonu ve çekirdeğe girişi üzerinden uyarır. İnterferon-gamma ise esas olarak Janus kinazın STAT1'i fosforile etmesi ve ardından STAT1'in çekirdeğe girmesi üzerinden uyarır. Sonrasında her faktör, iNOS promotöründeki kendi bölgesine bağlanır. Enzim aktivitesi ve gen indüksiyonu ayrı kontrol noktalarıdır; bir ilaç bunlardan birine veya her ikisine etki edebilir.

Makrofajlarda ve endotoksemili farelerde iNOS indüksiyonuna ilişkin 2015 çalışması, etkinin mesaj düzeyinde olduğunu gösterdi. RAW 264.7 hücrelerinde ve primer fare makrofajlarında lipopolisakkarit, interferon-gamma veya her ikisinden 30 dakika önce verilen 1 mikromolar metilen mavisi, 8 ila 24 saat boyunca iNOS proteinini ve mRNA'sını azalttı; kültür ortamındaki nitrit daha düşüktü ve hücre canlılığında kayıp yoktu. Kg başına 25 mg lipopolisakkarit verilen farelerde, bir saat önce uygulanan kg başına 5 mg'lık tek doz, akciğer, karaciğer ve kalpte iNOS proteinini ve mRNA'sını azalttı.

Ayırt edici ayrıntı, değişmeyen süreçlerdir. IkB-alpha yıkımı, NF-kB fosforilasyonu, STAT1 fosforilasyonu ve her iki faktörün çekirdekte birikmesi etkilenmedi. Aksama bir sonraki aşamada ortaya çıktı: çekirdek ekstraktları, lipopolisakkarit sonrasında NF-kB'nin kendi DNA bölgesine daha az bağlandığını, interferon-gamma sonrasında ise STAT1'in daha az bağlandığını gösterdi. Kromatin immünopresipitasyonu da hücre içindeki iNOS promotöründe her iki faktörün daha az bulunduğunu doğruladı. Promotörü yine NF-kB kullanan tümör nekroz faktörü alfa da azaldı. Faktörler aktive olmuş ve çekirdeğe ulaşmıştı, ancak hedef DNA'larına zayıf bağlanıyordu.

Yolak 1 ile arasındaki farka dikkat edin. Bu mekanizma faktörlerin DNA'ya bağlanmasıyla ilgilidir, STAT3 yerine STAT1'i kullanır ve ASC benekleri ile kaspaz-1 fragmanları yerine mRNA, protein ve nitriti ölçer. Hücre modellerinde metilen mavisinin hedef haritamız, bu transkripsiyon düzeyini doğrudan enzim ve mitokondri ölçümlerinden ayrı tutar.

Yolak 3: serum IL-6 ve dokularda STAT3 aktivasyonu

IL-6, gp130 reseptör ailesi üzerinden Janus kinazdan STAT3'e uzanan kaskada sinyal iletir. Fosforile STAT3 dimerleşir, çekirdeğe girer ve inflamatuvar programları harekete geçirir. IL-6'nın kendisi de bir NF-kB hedefidir; bu nedenle ikisi, sıklıkla IL-6–STAT3 ekseni olarak adlandırılan bir geri bildirim döngüsü oluşturur. Standart ölçülen çıktılar, yolağın üst kısmında serum IL-6 düzeyi, fosforile STAT3'ün toplam STAT3'e oranı ve alt kısmında iNOS ile COX2 gibi efektör enzimlerdir.

Lipopolisakkarit sonrasında IL-6 ve STAT3'e ilişkin 2023 fare çalışması, bu ekseni farklı kompartımanlarda ölçtü. Erkek C57BL/6 farelerine üç gün boyunca günlük kg başına 1 mg lipopolisakkarit verildi; her dozdan 30 dakika sonra kg başına 5 veya 10 mg metilen mavisi uygulandı. Üçüncü günde serum IL-6 düzeyi, her iki metilen mavisi grubunda da yalnızca lipopolisakkarit verilen gruba göre daha düşüktü; paneldeki diğer sitokinlerin çoğu ise uygulamayla değişmedi. Korteks, hipokampus ve kulak derisinde fosforile STAT3'ün toplam STAT3'e oranları daha düşüktü. Buna daha az Iba-1 mikroglia boyanması, daha düşük iNOS ve COX2 düzeyleri ve kısmen hafiflemiş kilo kaybı eşlik etti.

Burada iki uyarı önemlidir. Daha düşük serum IL-6 ile dokularda daha düşük STAT3 fosforilasyonunun birlikte görülmesi, eksenin modülasyonuyla uyumludur ancak birincil etki noktasını tek başına belirlemez. Çünkü yolağın üst kısmında daha az sitokin, daha az reseptör sinyalleşmesi veya değişmiş fosfataz aktivitesi aynı oranı oluşturabilir. Ayrıca üç günlük akut uyarı sırasında vücut ağırlığı, hayvanın bütününe ilişkin bir ölçümdür; bir belirti veya remisyon puanı değildir. Bu ölçüm, bir sinyalleşme sonucunu tedavi iddiasına dönüştürmeden, blot analizinin ötesinde bağlam sağlar. Mitokondriyal redoks süreçlerinin ayrı kimyası, bu sitokin açıklamasına paralel ilerler ve onunla birleştirilmemelidir.

Yolakların karşılaştırılması: müdahale noktaları ve ölçülen çıktılar

Tablo, üç geçersiz çıkarımı önler. ASC beneklerine ilişkin bir sonuç, STAT3'e ilişkin bir sonucu kanıtlamaz. STAT1'in iNOS promotörüne bağlanmasına ilişkin bir sonuç, her iki protein de STAT ailesinin üyesi olsa bile STAT3'e ilişkin bir sonucu kanıtlamaz. Serum IL-6'ya ilişkin bir sonuç, inflamazom oluşumunun azaldığını kanıtlamaz: periton deneyinde IL-1beta azalırken IL-6 azalmamıştır. Her satırın kendi tetikleyicisi ve ölçüm çıktısı gerekir. Bu nedenle hücre, hayvan ve klinik metilen mavisi çalışmalarını değerlendirirken her iddianın ölçüldüğü düzeyle eşleştirilmesi zorunludur.

Bunların hiçbiri insanlarda dozlamayı, güvenliliği veya yararı ortaya koymaz. Lipopolisakkarit modelleri, bir mekanizmayı test etmek için kullanılan kontrollü tetikleyicilerdir; kronik hastalıkların birebir karşılıkları değildir. Tetikleyiciyle birlikte doz uygulanması da yerleşmiş bir hastalığın geri çevrilmesini değil, tetiklenen bir değişimin önlenmesini test eder. Bu mekanizma açıklamasını hasta sonuçlarından ayrı tutun ve her sağlık iddiasını, arkasındaki hasta çalışmasına göre değerlendirin.