DNA ve RNA boyamada metilen mavisi: jel ve membran uygulamaları

Bir öğrenci agaroz jelde elektroforez yapar, jeli metilen mavisiyle boyar ve belirgin bir bant beklediği yerde hiçbir şey göremez. Yan çalışma alanında, doktora sonrası bir araştırmacı aynı mavi şişedeki boyayla bir Northern membranını boyar ve üç dakika içinde net ribozomal bantlar elde eder. Öğrenci jelin başarısız olduğu sonucuna varır. Oysa jel başarısız değildir. İki işlemin amacı farklıdır; aynı boya, bu amaçlara farklı duyarlılık, farklı arka plan ve sonraki işlemler için farklı kurallarla karşılık verir.

Metilen mavisiyle DNA boyama ve metilen mavisiyle RNA boyama aynı kimyaya dayanır, ancak amaçları aynı değildir. Jelde boya, gözenekli bir matriks içinde ne kadar nükleik asit bulunduğunu gösterir. Membranda ise transferin işe yarayıp yaramadığını ve hatlara eşit miktarda örnek yüklenip yüklenmediğini gösterir. Bu ayrım netleştiğinde protokoller, saptama sınırları ve uyumluluk sınırları da anlam kazanır.

Kısa yanıt

Metilen mavisi; fosfata yönelik elektrostatik çekim, baz çiftleri arasına interkalasyon ve küçük olukla etkileşimin birleşimi yoluyla nükleik asitlere kovalent olmayan, geri dönüşümlü biçimde bağlanan düzlemsel, katyonik bir boyadır. Burada asıl önemli olan bu geri dönüşümlülüktür. Bantlar görünür ışık altında boyanabilir, görüntülenerek kaydedilebilir ve ardından klonlama, hibridizasyon veya yeniden problama için boyadan arındırılabilir ya da saflaştırılabilir.

Çift zincirli DNA'nın metilen mavisiyle agaroz jelde boyanmasında standart hızlı tarif, suda yüzde 0.02 w/v (mL başına 200 mikrogram) boya ile yaklaşık 15 dakika boyama ve ardından yaklaşık 15 dakika suda boya giderme işlemidir; görüntüleme beyaz ışık kutusu üzerinde yapılır. Membranlar için klasik Northern blot tarifi, yaklaşık pH 5.2'de sodyum asetat içinde yüzde 0.02 ila 0.04 boyadır; transfer ve immobilizasyondan sonra birkaç dakika boyama yapılır, ardından suyla durulanır ve hibridizasyondan önce boya tamamen giderilir. Duyarlılık sınırlıdır: iyi koşullarda jel bandı başına onlarca ila yüzlerce nanogram; daha temkinli kılavuzlarda ise 0.5 ila 1 mikrogram belirtilir. Bu miktarlar, etidyum bromür ve SYBR boyalarının saptayabildiği miktarlardan birkaç büyüklük mertebesi daha yüksektir. Membranlarda tek bir transkript için kullanışlı bir saptama sınırı yoktur; çünkü boya esas olarak bol bulunan ribozomal RNA'yı ve yüklenen toplam materyali gösterir. Bu tariflerin hiçbirinde analitik boyanın yerine perakende satılan bir takviye çözeltisi kullanmayın. Doğrulanmış yöntemler, analitik saflıkta boya, tanımlı tamponlar ve RNA söz konusu olduğunda RNaz içermeyen çalışma koşulları varsayar.

Bağlanma nasıl gerçekleşir ve nerede yanıltır?

Kullanışlı modelin üç bileşeni vardır. Birincisi, pozitif yüklü halka sistemi negatif yüklü fosfat omurgasına çekilir. Metilen mavisinin DNA'ya bağlanmasına ilişkin bir spektroskopik çalışmada özetlendiği gibi, spektroskopik çalışmalar düşük tuz derişiminde bu elektrostatik bileşenin baskın olduğunu gösterirken, modelleme ve moleküler dinamik çalışmaları çift zincirli DNA için interkalasyonu ve küçük oluğa bağlanmayı kararlı bağlanma biçimleri olarak ortaya koyar. İkincisi, GC'ye yönelik bir miktar tercih vardır: metilen mavisinin interkalasyon tercihleri üzerine çalışmalarda modelleme CpG ve GpC adımlarını desteklerken, deneyler GC bakımından zengin çift zincirli yapılara tercihli bağlanma bildirmiştir; ancak AT çift zincirli yapıları da boyayı bağlar. Rutin boyama, diziye özgü değildir. Üçüncüsü, tek zincirli DNA ve RNA esas olarak elektrostatik etkileşimler ve erişilebilir bazlarla ve çift zincirli bölgelerle istiflenme yoluyla bağlanır; bu nedenle boyanma şiddeti uzunluğa, diziye ve ikincil yapıya göre değişir.

Bundan iki sonuç çıkar. Bağlanma kovalent olmadığı için boya yıkamayla uzaklaşır. Poliakrilamid bantları, özellikle sabitlenmedikleri sürece hızla solar; Soto ve Draper'ın PAGE jelleri için açıkladığı özel bir kalıcı sabitleme yöntemi de tam olarak normal boyamanın geçici olması nedeniyle geliştirilmiştir. Boya bir ışığa duyarlılaştırıcı olduğundan, boyanmış DNA'nın oksijen varlığında uzun süre güçlü ışığa maruz bırakılması guanini oksitleyebilir ve sonunda zincirlerde tek zincir kesikleri oluşturabilir; bu mekanizma metilen mavisinin duyarlılaştırdığı guanin oksidasyonu üzerine çalışmalarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kısa süreli beyaz ışıkla görüntüleme, klasik etidyum bromür iş akışlarındaki iyi bilinen UV hasarını önler; bu, preparatif geri kazanım için gerçek bir avantajdır. Görünür ışık daha az zarar vericidir, ancak zararsız değildir. DNA klonlanacaksa aydınlatma süresini kısa tutun. Bu uyarının arkasındaki daha geniş fotokimya bağlamı için metilen mavisi fotokimyasındaki iki yola bakın. Oksitlenmiş formun neden bağlandığını, indirgenmiş formun ise neden bağlanmadığını açıklayan redoks çifti ve yük durumları için metilen mavisinin yapısı ve özelliklerinin kimyasına bakın.

Birinci görev: jellerin içinde boyama

Jel boyama tek bir soruya yanıt verir: Bu bantta gözle görülebilecek kadar nükleik asit var mı? En iyi tanımlanmış örnek, agaroz içindeki çift zincirli DNA'dır. Flores ve çalışma arkadaşlarının özgün metilen mavisi jel yöntemi, yüzde 1 agarozda yüzde 0.02'lik hızlı protokolü doğrulamış ve sonrasında başarılı geri kazanım ve klonlama göstermiştir. Aynı tedarikçi protokolü, yüzde 0.04'lük membran tarifini ve hızlı jel yöntemini yan yana sunan IBI Scientific metilen mavisi ürün sayfasında da yer alır.

Pratik iş akışı:

1. Jel elektroforezini normal şekilde yürütün. Değiştirilmiş bir yöntem için transfer veya ayırma performansı doğrulanmadıkça, boyamayı elektroforez sırasında değil, sonrasında yapın.
2. Jeli, hafifçe çalkalayarak yaklaşık 15 dakika boyunca distile suda yüzde 0.02 w/v metilen mavisine daldırın.
3. Matriksin arka plan rengi azalıp bantlar belirginleşene kadar, suyu birkaç kez değiştirerek toplam yaklaşık 15 dakika boyayı giderin.
4. Beyaz ışıklı bir aydınlatıcı üzerinde gecikmeden fotoğraf çekin.

Agaroz ve poliakrilamid farklı davranır. Agaroz, boyayı matriks içinde tutar; dolayısıyla yavaş olan adım boya giderme işlemidir. İnce poliakrilamid jeller hızla boyanır, ancak boyayı da hızla kaybeder; bu durum preparatif bant kesimini kolaylaştırırken arşivlik kayıt almayı zorlaştırır. Yerleşik Current Protocols tarzı PAGE yöntemleri izlenerek, poliakrilamid içindeki sentetik oligonükleotitlerin yerleri aynı yüzde 0.02'lik tarifle ve tekrarlanan su yıkamalarıyla 20 ila 30 dakikada belirlenebilir. Preparatif oligonükleotitler için, seyreltik TBE içinde yaklaşık yüzde 0.0002'lik çok seyreltik çözeltilerle birkaç saat süren yöntemler bildirilmiştir; ancak bunların kanıt temeli daha zayıftır.

DNA ile RNA arasındaki fark önemlidir. Çift zincirli DNA, en güçlü yapılandırılmış bağlanmayı sağlar. RNA ve tek zincirli DNA da boyanır, ancak daha zayıf ve daha az öngörülebilir biçimde. Formaldehitli agaroz RNA jellerinde çoğu laboratuvar jel içinde mavi boyamayı atlar ve RNA'yı önce bir membrana aktararak orada boyar. Bu yaklaşım, zayıf bir jel sinyali yerine daha net bir membran sinyali ve bir yükleme kaydı sağlar.

İkinci görev: membranlar üzerinde boyama

Membran boyama farklı bir soruya yanıt verir: Transfer işe yaradı mı ve hatlar karşılaştırılabilir mi? Klasik uygulama, Herrin ve Schmidt'in geri dönüşümlü Northern blot boyamasıdır. Özgün yöntemde pH 5.0'da 50 mM sodyum asetat içinde yüzde 0.04 boya ile 2 ila 3 dakika boyama yapılır ve suyla durulanır; boya, hibridizasyondan önce SSPE içindeki seyreltik SDS ile uzaklaştırılabilir.

Yaygın kullanılan modern yöntem şöyledir:

1. RNA'yı veya denatüre DNA'yı naylon ya da nitroselüloza aktarın; ardından boyama sırasında örneğin kaybolmaması için UV ile çapraz bağlayarak veya ısıtarak immobilize edin.
2. İsteğe bağlı, ancak yaygın bir adım: Membranı yaklaşık 15 dakika yüzde 5 asetik asitle ıslatın.
3. Yaklaşık pH 5.2'de 0.3 ila 0.5 M sodyum asetat içinde yüzde 0.02 ila 0.04 metilen mavisiyle 5 ila 10 dakika boyayın.
4. Suyla durulayıp 5 ila 15 dakika suda boyayı giderin, görüntüyü kaydedin ve ardından hibridizasyondan önce kalan boyayı uzaklaştırın.

Northern çalışmalarında en yaygın membran, pozitif yüklü naylondur. Nitroselüloz da aynı asetik asit ve asetat iş akışıyla kullanılabilir. Görüntü; transferi doğrulamak, 28S ve 18S bantlarını karşılaştırmak (bakteriyel RNA için 23S ve 16S), merdivenleri ve standartları işaretlemek ve yaklaşık bir toplam RNA normalizasyon kaydı tutmak için kullanılır. Yayımlanmış Northern yöntemleri, yükleme kontrolleri için boyanmış ribozomal bantları nicel olarak değerlendirir; bunlar arasında normalizasyon için metilen mavisiyle boyanmış ribozomal bantları kullanan süt bilimi çalışmaları da vardır. Southern membranları da aynı şekilde görüntülenebilir; ancak boyanın Northern yükleme ve transfer kontrolündeki kullanımı çok daha yerleşiktir. Ayrıca Southern DNA'sı transferden önce denatüre edildiğinden, jel için verilen duyarlılık değerleri burada geçerli değildir.

Saptama sınırları ve arka plan: mavi boyanın geride kaldığı noktalar

Aşağıdaki karşılaştırma bilinçli olarak yaklaşık değerler verir. Boyanın performansı jel yüzdesine, bant genişliğine, optik sisteme ve boya giderme işleminin titizlikle uygulanmasına bağlıdır. Her sayıyı kesin bir teknik özellik değil, bir büyüklük mertebesi olarak değerlendirin.

Sınırlı sinyalin kullanılabilir olup olmadığını arka plan kontrolü belirler. Serbest boya yoğun renklidir; bu nedenle kontrast, bağlı boyayı uzaklaştırmadan bağlanmamış boyanın giderilmesiyle elde edilir. Daha derişik boya, duyarlılığı nadiren artırır. Esas olarak boya giderme süresini uzatır. Kullanacağınız jel, membran ve kamerayla bir seyreltme serisi çalışın ve yalnızca entegre yoğunluğun yüklenen miktarla orantılı kaldığı aralığı kullanın. Metilen mavisi, yarı nicel yükleme normalizasyonuna olanak sağlar. Membran kapasitesi, transfer verimliliği, doygunluk ve boya giderme hatlar arasında değiştiği için yüksek dinamik aralıklı nicel bir analiz değildir.

Uyumluluk sınırları: boyamadan sonra hangi işlemler yapılabilir?

Mavi boyamadan sonra klonlama yapılabildiği gösterilmiştir. Flores ve çalışma arkadaşları, boyanmış agaroz bantlarını kesip çıkarmış, DNA'yı geri kazanmış, ligasyon ve transformasyon yapmış ve UV ile birlikte kullanılan etidyum bromürden sonra elde edilene göre daha iyi klonlama sonuçları bildirmiştir. Olası neden, boyanın kendisinin sağladığı bir fayda değil, daha az ışık hasarıdır. Beyaz ışığa maruz kalma süresini kısa tutun ve geri kazanılan DNA'yı standart bir jel ekstraksiyonu saflaştırma işleminden geçirin.

PCR ve dizileme için kanıtlar daha sınırlıdır. Kalan boya nükleik asitlere bağlandığından, enzimatik adımlardan önce boyayı giderin ve saflaştırma yapın. Maviyle boyanmış bir jelden uygun şekilde saflaştırılmış DNA'nın çalışması beklenir; ancak farklı polimerazların ve dizileme kimyalarının doğrudan taşınan boyaya toleransı yeterince nicel olarak belirlenmemiştir. Bunu varsaymayın.

İşlem sırası kesin olarak korunduğunda blot hibridizasyonu uyumludur: transfer, immobilizasyon, boyama, kayıt, boya giderme, hibridizasyon. Bu sıra, Herrin ve Schmidt yönteminin temelidir. Transferden önce boyama yapmak veya boya giderme adımını atlamak farklı bir yöntemdir ve ayrıca doğrulanması gerekir. Boya uzaklaştırıldıktan sonra standart prob sökme ve yeniden problama işlemleri normal şekilde yürütülür. Aynı boya ailesiyle hücre düzeyinde boyama ve sabitlenmiş preparat yaklaşımının neden canlı hücre yöntemlerine aktarılamadığı için mikroskopi boyama atlasına bakın.

Kalıcı sabitleme yönteminden kaçınılması koşuluyla, bant kesip çıkarma işlemi preparatif agarozda ve mavi boyayla yerleri belirlenen PAGE oligonükleotitlerinde kullanılabilir. Boya giderme işleminden sonra elektroelüsyon, geri dönüşümlü bağlanan bir boya için kimyasal açıdan makuldür; ancak metilen mavisine özgü kontrollü verim verileri sınırlıdır. Elüsyondan sonra tuzları uzaklaştırın veya çöktürme yapın.

Tekrarlayan sorunlar

Soluk jel bantları genellikle kolorimetrik bir boya için kütlenin yetersiz olduğu anlamına gelir; bu özellikle kısa tek zincirli hedefler veya RNA hedefleri için geçerlidir. Daha fazla örnek yükleyin, taze boya kullanın, derişimi artırmadan önce boyama süresini uzatın ve boya giderme işlemini daha erken durdurun. Kontrastı olmayan, tamamen mavi bir jel genellikle aşırı boyama veya suyun yeterince değiştirilmemesi anlamına gelir. PAGE bantlarının solması, boyamanın başarısızlığı değil, beklenen kimyasal davranıştır. Hızla fotoğraf çekin. Membranda düzensiz arka plan; katlanmalara, kabarcıklara, parmak izlerine, düzensiz çalkalamaya veya yer yer gerçekleşen transfere işaret eder. Hibridizasyon kontrolü olmadan bunu eşit olmayan yükleme olarak yorumlamayın. Yayılmış, zayıf bir ribozomal bant deseni bozunma anlamına gelebilir; ancak eksik transfer, toplam RNA'nın çok az olması (tipik hatlar birkaç ila onlarca mikrogram içerir) veya aşırı boya giderme de aynı görünümü oluşturabilir. Boya, bol bulunan ribozomal RNA'yı gösterir. Belirli bir transkripti göstermez. Bu görev proba aittir.

Abartısız güvenlik ve kullanım bilgileri

Metilen mavisinin kullanımı etidyum bromürden daha basittir, ancak zararsız değildir. Güncel bir MilliporeSigma güvenlik bilgi formu, boyayı akut oral toksisite Kategori 4 kapsamında sınıflandırır ve yutulması halinde zararlı olduğunu belirtir; Sigma-Aldrich metilen mavisi güvenlik bilgi formuna göre bertaraf, onaylı bir atık yönetimi yoluyla yapılmalıdır. Etidyum bromür için daha güçlü genotoksisite uyarıları vardır; bunlar arasında Sigma-Aldrich etidyum bromür güvenlik bilgi formunda belirtilen şüpheli eşey hücresi etkileri de bulunur. Thermo Fisher nükleik asit boyası kılavuzunda belirtildiği gibi, etidyum bromür içeren jeller ve çözeltiler genellikle tehlikeli kimyasal atık olarak ayrı toplanır. Her ikisi için de güvenlik bilgi formuna ve kurum kurallarına uyun. Kuru boyayı ağzı sıkıca kapalı ve kuru tutun, çalışma boyasını yalnızca protokolün izin verdiği ölçüde yeniden kullanın, boyanmış membranları filtre kâğıtları arasında kuru olarak saklayın ve bantlar difüzyonla dağılmadan önce jellerin fotoğrafını çekin.

Laboratuvar tezgâhında şu özeti hatırlayın. Jeller, yüksek yükleme miktarında beyaz ışık altında görünürlüğü sınar. Membranlar, prob duyarlı saptama işini yapmadan önce transferi ve yüklemeyi sınar. Tek bir boya, sınırlı duyarlılık, geri dönüşümlü bağlanma ve kesin bir işlem sırasıyla her iki amaca da hizmet eder.