Metilen mavisi ve ALS: sonuçlar deneysel modeller arasında neden farklılaşıyor?

Metilen mavisi ve ALS hakkında arama yaptığınızda, birbiriyle çelişiyor gibi görünen iki iddiayla karşılaşırsınız. Biri, mavi boyanın ALS modellerinde nöronları koruduğunu söyler. Diğeri ise bir ALS faresinde hiçbir etkisi olmadığını belirtir. Her iki iddia da gerçek makalelere dayanır ve her iki makale de ciddiye alınmaya değerdir. Her deneyin arkasındaki temel anlayışı ortaya koyduğunuzda çelişki ortadan kalkar: model, iddianın kapsamını belirler.

Bir solucanda elde edilen sonuç, solucanla ilgili bir iddiadır. Larva evresindeki bir balıkta elde edilen sonuç, larva evresindeki bir balıkla ilgili bir iddiadır. Bir memelideki hastalık seyri bunu desteklemedikçe, hiçbiri bir hastayla ilgili bir iddia değildir. Bu makale, yanıtlarının neden farklı olduğunu görebilmeniz için en çok atıf yapılan iki makaleyi yan yana karşılaştırır.

İki deney tek tabloda

Okurken bu tabloyu açık tutun. Çalışmalar arasındaki tüm önemli farklar burada yer alıyor.

Genetik farklı, türler farklı, dozun uygulanma yolu farklı, zamanlama farklı ve sonlanım noktaları farklı. Genotip, beş farktan yalnızca biri olduğundan, bu iki çalışma metilen mavisinin tek bir ALS yolağında seçici olarak etkili olduğunu kanıtlayamaz. Daha dar kapsamlı ama yine de yararlı bir şeyi gösterir: basit modellerde erken ve doğrudan maruziyetle sağlanan güçlü düzelme, ağız yoluyla uzun süreli uygulamanın yapıldığı bir memeli hastalık seyrine yansımamıştır.

Olumlu sonuç: solucan ve balık çalışması ne gösterdi?

2012 tarihli solucan ve balık çalışmasında, solucan motor nöronlarında mutant insan TDP-43 veya FUS ifade ettirildi ve balık embriyolarına mutant insan mRNA'sı enjekte edildi. Bunlar proteotoksisite modelleridir. Yetişkin insan ALS'sinin yıllar süren tüm seyrini değil, mutant proteinin günler içinde hareket ve nöron şekli üzerindeki toksik etkilerini yeniden oluştururlar.

Tedavi çok erken başladı. Solucanlar, yumurtadan çıktıkları andan itibaren metilen mavisi içeren agar üzerinde büyüdü. Balık embriyoları, döllenmeden 24 saat sonra başlayarak gece boyunca ilaç çözeltisinde tutuldu; davranışları yaklaşık iki gün sonra test edildi. İlaç ile nöron arasında, memelilerde olduğu gibi bir kan-beyin bariyeri bulunmuyordu ve plazma ya da beyindeki ilaç düzeyi ölçülmedi.

Bu koşullarda etkiler büyük ve tutarlıydı. Hem 6 hem de 60 μM, TDP-43 ve FUS solucanlarında yaşa bağlı felci azalttı. Erişkinliğin 12. gününde, tedavi edilmeyen TDP-43 solucanlarının yaklaşık yüzde 80'i felçliydi; yumurtadan çıkıştan itibaren tedavi edilenlerde bu oran yaklaşık yüzde 10'du. Bir sinaptik test de aynı yönde sonuç verdi: TDP-43 solucanları, nöromüsküler iletimi incelemek için kullanılan aldikarb adlı ilaca aşırı duyarlıydı ve metilen mavisi yanıtı normale yaklaştırdı. Dejenerasyona uğrayan motor nöron uzantılarının sayısı azaldı; en belirgin etki 60 μM düzeyinde görüldü. Balıklarda dokunmayla tetiklenen yüzme önemli ölçüde iyileşti ve kısalmış motor aksonlar 30 veya 60 μM düzeyinde normal uzunluklarına doğru yeniden uzadı; ancak düzelme tam değil, kısmiydi.

Oksidatif stres verileri, antioksidan etki yorumuyla uyumluydu. Mutant solucan ve balıklarda reaktif oksijen ölçümleri yüksek bulundu ve tedaviyle azaldı; metilen mavisine maruz bırakılan normal solucanlar ise prooksidan bir zorlanma karşısında tedavi edilmeyen solucanlardan çok daha uzun süre hayatta kaldı. Ancak iki sınırlama önemlidir. Toplam mutant TDP-43 ve FUS protein düzeyleri düşmedi ve çalışma protein agregatlarını doğrudan nicel olarak ölçmedi; dolayısıyla agregatların temizlendiğini kanıtlamadan işlevsel düzelme gösteriyor. Redoks ve mitokondriyle ilgili hipotezlerin genellikle nasıl çerçevelendiğini takip eden herkes, bu mekanizmayı desteklenen ancak kesinleşmemiş bir açıklama olarak görmelidir.

Zamanlama, en öğretici ayrıntıydı. Yazarlar tedaviye başlamak için erişkinliğin 5. gününe kadar beklediğinde, 12. gündeki felç oranı yaklaşık yüzde 55 oldu; yumurtadan çıkıştan itibaren tedavide ise bu oran yaklaşık yüzde 10'du. Aynı ilaç, aynı solucan, aynı mutasyon; çok daha küçük bir etki. Görünen yararın büyük kısmı erken koruyucu maruziyete bağlıydı.

Anlamlı etki bulunmayan sonuç: SOD1 fare çalışması ne gösterdi?

2011 tarihli fare çalışması, daha sıkı bir sistemde daha zor bir soruyu ele aldı. Konjenik SOD1 G93A fareleri, arka uzuv titremesinden yürüme bozukluğuna ve doğrulma refleksinin kaybına, ardından önceden tanımlanmış bir sonlanım noktasına ilerler. Tedavi, belirtiler ortaya çıkmadan önce 45. günde başladı ve her gün sürdürüldü; gözlemciler nörolojik durumu 0 ila 6 ölçeğinde puanladı. Bu, hastalığın tüm seyrini kapsayan bir deneydir; dolayısıyla bir solucandaki herhangi bir felç eğrisine kıyasla, bir hastanın önemseyeceği sonuçlara daha yakındır.

Başlıca sonuçlarda anlamlı etki görülmedi. Genel başlangıç, kontrol grubunda 121 günde, metilen mavisi grubunda ise 124 günde gerçekleşti; fark anlamlı değildi. Son evreye kadar sağkalım 167 güne karşı 170 gündü; bu fark da anlamlı değildi. Birkaç ikincil analiz tedavi lehineydi: dişilerde başlangıç yaklaşık 7 gün gecikti ve tedavi edilen hayvanlar daha hafif evrelerde biraz daha fazla, ağır evrelerde ise daha az zaman geçirdi. Cinsiyete göre alt grupların küçük olması ve çok sayıda evre karşılaştırması yapılması nedeniyle, bu bulgular kanıt olmaktan çok hipotez oluşturucu niteliktedir. Nöron sayımları, SOD1 agregasyon testi ve oksidatif ya da inflamatuvar belirteç ölçümleri yapılmadı; bu nedenle çalışma, ilacın hedeflerine ulaşıp başarısız mı olduğunu, yoksa bu dozda hedefleriyle hiç etkileşime girmediğini de söyleyemez. Yalnızca bir doz test edildi.

Yazarlar, her iki yönde de geçerli olan en temel sınırlamayı kendileri vurguladı. Yüksek kopya sayılı SOD1 G93A, toksik SOD1 hastalığını iyi modeller; ancak SOD1 hastalığı ailesel ALS'nin küçük bir bölümünü oluşturur ve sporadik hastalığın çoğundan farklı bir biyolojiye sahiptir. Aday bileşiklerin TDP-43 temelli memeli modellerinde yeniden test edilmesini önerdiler. Solucan ve balık çalışmasının yazarları, metilen mavisiyle yapılan ayrı bir TDP-43 fare çalışmasının da motor sonuçları iyileştiremediğini belirttiği için, bu öneri daha karmaşık hâle gelmiştir. Dolayısıyla bir bileşik, bir TDP-43 sisteminde güçlü etki gösterirken başka bir TDP-43 sisteminde etkisiz görünebilir. Sistem, gen kadar önemlidir.

Solucan veya balıktaki iyileşme neden hastalarda yararı kanıtlayamaz?

Her modeli farklı bir soruya yanıt veriyor gibi düşünün.

Birincisi, biyoloji farklıdır. TDP-43 ve FUS, bu basit sistemlerde ortak genetik etkileşimlere sahip nükleik asit bağlayıcı proteinlerdir; SOD1 toksisitesi ise kısmen farklı, daha doğrudan mekanizmalar üzerinden işler. Bir proteotoksik stresi hafifleten ilaç, diğerini hafifletmek zorunda değildir. Embriyonik aşırı ifadeye karşı başarı da inflamasyon, glial hücrelerin katılımı ve sistemik kötüleşmeyle birlikte ilerleyen, yetişkinlikteki yavaş nörodejenerasyona karşı başarıyı öngörmek zorunda değildir.

İkincisi, maruziyet farklıdır. Mikromolar konsantrasyonlarda sürekli banyo maruziyeti, ağız yoluyla doz uygulaması değildir. Bağırsak emilimi, ilk geçiş metabolizması, plazma proteinlerine bağlanma, beyne geçiş ve klirens; yutulan bir doz ile omurilikteki bir motor nöron arasında yer alan süreçlerdir. Her iki çalışma da sinir sistemindeki ilaç düzeylerini ölçmediğinden, hiçbiri kendi konsantrasyonunu diğer çalışmanınkiyle ilişkilendiremez.

Üçüncüsü, zamanlama farklıdır. Solucan ve balıklardaki yararlar, büyük ölçüde patoloji birikmeden önce tedaviye başlanmasına bağlıydı. Farelerde de tedavi belirtiler ortaya çıkmadan önce başladı; bu, çalışmanın güçlü bir yönüdür. Ancak insanlarda tedavi neredeyse her zaman belirtiler başladıktan sonra, yani daha da geç başlayacaktır. İki günlük bir embriyo testindeki koruyucu etki sinyali, araştırma için bir başlangıç noktasıdır; klinik kullanım modeli değildir.

Dördüncüsü, sonlanım noktaları farklıdır. 12. gündeki felç, aldikarb duyarlılığı, mikrometre cinsinden akson uzunluğu ve yüzme mesafesi, doğrudan mekanizmalara yakın fenotiplerdir. Bir memelide başlangıç ve sağkalım, vücuttaki tüm telafi edici ve süreci karmaşıklaştıran mekanizmaların birleşik etkisini yansıtır. İlaçlar sıklıkla bu doğrudan ölçümleri değiştirirken sağkalımı değiştirmez; memelilerde olaya kadar geçen süreyi temel alan sonlanım noktalarının kullanılmasının nedeni budur.

Bir sonraki çarpıcı haber için kontrol listesi isteyen okuyucular, klinik öncesi çalışmalar nasıl okunur? yazısından yararlanabilir: türü, transgeni, dozu ve uygulama yolunu, ilaç düzeylerinin ölçülüp ölçülmediğini, tedavinin patolojiye göre ne zaman başladığını, sonlanım noktasının kısa süreli bir fenotip mi yoksa hastalık seyri mi olduğunu ve etkinin ikinci bir laboratuvarda tekrarlanıp tekrarlanmadığını sorgulayın. Bu erken sinyallerden herhangi birinin klinik verilere dönüşüp dönüşmediğini kontrol etmek için başvurulacak yer, metilen mavisine ilişkin daha geniş insan verileridir.

Bu, hastalar ve aileleri için ne anlama geliyor?

Bu makalelerden ALS için yerleşik bir metilen mavisi protokolü çıkarılamaz. Olumlu sonuç veren çalışma, TDP-43 ve FUS biyolojisindeki oksidatif ve sinaptik mekanizmalar üzerine daha fazla araştırmayı destekler. Anlamlı etki bulunmayan çalışma ise SOD1 tipi hastalıkta bu maruziyet düzeyindeki uzun süreli ağız yoluyla uygulamadan hastalık seyrini değiştirici etki beklenmesini desteklemez. Birlikte değerlendirildiklerinde, bir tedavi önerisi değil, modeller arası tutarsızlık ortaya koyarlar.

Güvenlik de etkililik kadar temkinli biçimde ele alınmalıdır. Farelerdeki ALS çalışmaları, insanlarda güvenli doz uygulaması hakkında bilgi vermez. Metilen mavisi, G6PD eksikliğinde hemoliz ve serotonerjik ilaçlarla birlikte kullanıldığında serotonin toksisitesi gibi gerçek riskler taşır. Şüpheli G6PD eksikliği, mevcut antidepresan kullanımı ve ilaç tedavisinde planlanan her değişiklik bir hekimle görüşülmelidir; laboratuvar bulgularına ilişkin çarpıcı haberlere dayanarak harekete geçmeden önce metilen mavisine ilişkin genel güvenlik verileri de gözden geçirilmelidir.

Sonuç tek bir cümleye sığar. Metilen mavisi, erken maruziyetle TDP-43 ve FUS solucan ve balık larvası fenotiplerinde güçlü düzelme sağladı; ağız yoluyla uzun süreli uygulamanın yapıldığı bir SOD1 fare çalışmasında ise başlangıç veya sağkalım açısından esasen hiçbir yarar göstermedi. Dolayısıyla dürüst yorum, bunların hastalarda kullanımı desteklemeyen, modele bağlı kanıtlar olduğudur.