G6PD laboratuvar testlerinde metilen mavisi: boya aslında ne yapıyor?

Bir öğrenci, inkübasyondan sonra iki tüpü izliyor. Biri beklenen renge dönmüş. Diğeri dönmemiş. Öğrenci, ikinci hastada glukoz-6-fosfat dehidrogenaz eksikliği olduğu sonucuna varıyor. Bu sonuç doğru olabilir, ancak bu akıl yürütme, testin çalışmasını sağlayan kavramı atlıyor. Tüpteki hiçbir şey enzimi doğrudan ölçmüyor. Tüp, metilen mavisini aracı olarak kullanarak enzimin ürettiği şeyi ölçüyor.

Bu dolaylı ölçüm anlaşıldığında, testin uygulanışı, kontroller ve uzun yanlış sonuçlar listesi artık keyfî görünmez.

Kısa yanıt

G6PD testlerinde metilen mavisi bir redoks göstergesidir. G6PD enzimi NADPH üretir; NADPH'ye bağımlı sistemler ise mavi renkli metilen mavisini renksiz löko formuna indirger veya elektron taşımak için kullanır. Normal enzim aktivitesi etkin indirgenme sağlar. Eksik aktivite, yavaş veya tamamlanmamış indirgenmeye yol açar. Ölçülen sinyal bundan ibarettir.

Geçmişte kullanılan iki yöntem aynı boyayı kullanır, ancak son noktaları farklıdır. Bunları birbirinden ayırdığınızda karışıklığın büyük bölümü ortadan kalkar.

İki test, tek boya, farklı son noktalar

İlki, Sass ve çalışma arkadaşlarının tanımladığı ve daha sonra Gibbs'in değerlendirdiği doğrudan metilen mavisi indirgenme testidir. Burada son nokta boyanın kendisidir: oksitlenmiş mavi metilen mavisi, renksiz lökometilen mavisine doğru indirgenir ve bu değişimin hızı NADPH üretme kapasitesini yansıtır. İlk tarama makalesi PubMed'de Sass ve ark. (1966) adıyla indekslenmiştir.

İkincisi, Brewer methemoglobin indirgenme testidir. Sodyum nitrit önce hemoglobini kahverengi methemoglobine oksitler. Ardından metilen mavisi, elektron aktarım aracısı olarak görev yapar: indirgenmiş metilen mavisi, indirgeme eşdeğerlerini methemoglobine aktararak onu yeniden kırmızı hemoglobine dönüştürür. Bu nedenle gözle görülen son nokta, mavi ile renksiz arasındaki fark değil, kahverengi ile kırmızı arasındaki farktır. Özgün yöntem Dünya Sağlık Örgütü Bülteni'nde (Brewer ve ark., 1960) yayımlanmıştır.

Brewer testini boyanın renksizleşmesi testi olarak adlandırmak kimyasal açıdan tam doğru değildir. Boya bir döngü içinde işlev görür; rengi değişen hemoglobindir. Aşağıdaki şema her iki yolu da gösterir.

Temel reaksiyon

G6PD, pentoz fosfat yolunun ilk oksidatif basamağını katalizler:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Luzzatto ve çalışma arkadaşlarının Blood dergisindeki derlemesinde (2020) açıklandığı gibi, olgun eritrositler NADPH için büyük ölçüde bu yola bağımlıdır. NADPH, glutatyonu indirgenmiş durumda tutar ve hücreyi oksidatif hasara karşı korur. Metilen mavisi bu sisteme elektron alıcısı olarak katılır. Yeterli G6PD, yeterli NADPH sağlar; bu da etkin indirgenme sağlar. Düşük G6PD düzeyi, zinciri ilk halkasında koparır.

Boyayı motor değil, yakıt göstergesi olarak düşünün. NADPH kaynağı hakkında bilgi verir. Bu kaynağı veya ölçüm sonucunu değiştiren başka herhangi bir etken, gende hiçbir değişiklik olmadan göstergeyi oynatabilir.

Brewer tipi test nasıl uygulanır?

Reaktif formülleri yıllar içinde değişmiştir; bu nedenle eğitim amaçlı bir açıklama klinik protokol olarak görülmemelidir. Her laboratuvar kendi doğrulanmış standart çalışma prosedürünü izler. Bu uyarı göz önünde bulundurulduğunda, klasik tüp düzeni, bu yayımlanmış uygulamada üç tüp ve 3 saatlik inkübasyonla belgelendiği biçimiyle şöyle işler:

1. Hasta tüpü: tam kan, glukoz, sodyum nitrit ve metilen mavisi içerir. Nitrit methemoglobin oluşturur, glukoz eritrosit metabolizmasını besler ve boya NADPH'ye bağımlı elektron aktarımını sağlar.
2. Oksitlenmiş kontrol: kan, nitrit ve glukoz içerir, ancak metilen mavisi içermez. Eksiklik örüntüsünü temsil eden kahverengi methemoglobin son noktasını gösterir.
3. Hemoglobin kontrolü: kan ve su içerir. Normal örüntüyü temsil eden kırmızı hemoglobin son noktasını gösterir.
4. Tüm tüpleri yaklaşık 37 C'de, genellikle 3 saat boyunca hafifçe karıştırarak inkübe edin.
5. Hücreleri parçalamak ve renk karşılaştırmasını okunabilir hâle getirmek için her tüpten küçük bir alikotu distile suyla seyreltin.
6. Hasta tüpünü iki kontrolle karşılaştırın. Rengin yeniden kırmızıya yaklaşması, belirgin bir indirgeme kapasitesini gösterir. Kahverenginin devam etmesi, belirgin eksikliği düşündürür.

Geçmişte kullanılan bir formülasyonda yaklaşık 1 mL kan ile yaklaşık 180 mM sodyum nitrit, 280 mM dekstroz ve 0.4 mM metilen mavisi içeren reaktifler kullanılmıştır. Bu sayıları evrensel bir teknik şartname olarak değil, literatürden bir örnek olarak değerlendirin.

Sonucun okunması

G6PD'nin saptanmasındaki boşlukları ele alan bu Malaria Journal derlemesinde tartışıldığı gibi, nitel bir tarama normal aktivitenin yüzde 30 ile 40'ı civarında en iyi ayrımı sağlar. Bu nedenle normal bir tarama sonucu, testin ağır eksiklik saptamadığı anlamına gelir. Aktivitenin tamamen normal olduğunu doğrulamaz.

Tarama neden yanıltır?

Hemoliz sonrası retikülositoz, klasik bir yalancı normal sonuç nedenidir. Genç eritrositler ve retikülositler, yaşlı hücrelere göre daha fazla G6PD taşır. Akut bir hemolitik olay sırasında en yaşlı ve en belirgin eksikliğe sahip hücreler zaten parçalanmış olabilir; geriye aktivitesi testte normal çıkan genç bir hücre topluluğu kalır. Aynı biyolojik durum yalnızca boya temelli taramaları değil, nicel testleri de yanıltır.

Yakın zamanda yapılan transfüzyon, donör eritrositleri örneğe kendi enzimlerini kattığı için eksikliği maskeler. Mayo Clinic Laboratories, transfüzyonu retikülositoz ve lökosit interferansıyla birlikte güvenilir olmayan enzim sonuçlarının nedenleri arasında listeler.

Heterozigot kadınlar, değerlendirmesi en zor gruptur. Rastgele X kromozomu inaktivasyonu, normal ve G6PD eksikliği olan eritrositlerden oluşan bir karışım oluşturur; toplam aktivite ağır eksiklikten görünüşte normale kadar herhangi bir düzeyde olabilir. Nitel taramalar ara düzey fenotipleri sıklıkla kaçırır. WHO'nun G6PD testlerine ilişkin belgeleri bu sınırlılığı ayrıntılı olarak ele alır.

Örneğin yaşı, saklama sıcaklığı, görsel son noktanın öznel değerlendirilmesi, hematokrit ve reaktif kalitesi, bu biyolojik etkilerin üzerine analitik belirsizlik ekler.

Tarama tanı değildir

Eksiklik gösteren, ara düzeyde olan veya klinik bulgularla uyuşmayan bir tarama sonucu, nicel G6PD enzim testi gerektirir. WHO, sıcaklık kontrollü nicel spektrofotometriyi referans yaklaşım olarak kabul eder. Bu testte eritrosit hemolizatına glukoz-6-fosfat ve NADP+ eklenir; oluşan NADPH, 340 nm'deki absorbans artışıyla izlenir. Değişim hızı enzim aktivitesiyle orantılıdır ve genellikle gram başına birim olarak hemoglobin miktarına göre normalize edilir. Güncel klinik laboratuvar uygulamaları, Mayo test kataloğunun G6PD aktivitesi bölümünde özetlenmiştir.

Yorumlamada laboratuvarın doğrulanmış referans aralığı kullanılır. Bu aralık genellikle popülasyondaki normal aktiviteye göre tanımlanır; eksiklik çoğunlukla yüzde 30 eşiği civarında, ara düzey aktivite ise bunun üzerinde ele alınır. WHO'nun G6PD testleri için hedef ürün profilleri (2022) bu tanısal çerçeveyi ortaya koyar. Yakın zamanda gerçekleşen hemoliz veya transfüzyon fenotiplemeyi güvenilmez kılıyorsa, eritrosit topluluğu yeniden dengeye ulaştıktan sonra testi tekrarlayın; moleküler testler de enzim ölçümünün yerini almadan ek bilgi sağlayabilir.

Korunması gereken bir ayrım

Bu testlerde metilen mavisi bir ex vivo laboratuvar reaktifidir. Bu durum, bir hastaya metilen mavisi verilmesinin güvenliğinden ayrı bir konudur; bu konu metilen mavisinin kontrendikasyonlarına ilişkin rehberde ele alınmaktadır. İlaç da NADPH'ye bağımlı indirgenmeye ihtiyaç duyduğu için biyokimya bu iki konuyu birbirine bağlar; ancak test tüpündeki boya, kan dolaşımındaki bir doz değildir. Boyanın farklı bir ortamda boyama maddesi olarak nasıl davrandığına ilişkin bağlam için metilen mavisiyle boyamanın ilkelerine, ait olduğu kimyasal aile için ise laboratuvardaki redoks boyalarına bakın.

Tarama, indirgeme kapasitesinin korunmuş görünüp görünmediğini sorar. Doğrulama ise gerçekte ne kadar enzim bulunduğunu sorar. Kimse boyadan ikinci soruyu yanıtlamasını beklemediği sürece, boya ilk soruya iyi yanıt verir.