EMB agarda E. coli ve diğer koloni görünümlerinin yorumlanması

Bir öğrenci, bilinmeyen bir mikroorganizmayı eozin metilen mavisi agara çizgi ekim yöntemiyle eker, gece boyunca inkübe eder ve ertesi gün yeşil ışıltılı koyu koloniler içeren bir plakla karşılaşır. Defterine "E. coli, doğrulandı." yazar. Bu kayıt, plağın destekleyebileceğinden daha güçlü bir iddia içerir. Plak, belirli koşullar altında bir üreme ve fermantasyon fenotipi gösterir. Tür kimliği ise ayrı kanıt gerektiren ayrı bir iddiadır.

Bu rehber, EMB agar sonuçlarını bir yorumlama görevi olarak ele alır. Temel prensibi açıklar, kontrollerle birlikte örnek bir plak atlasını inceler ve ders kitaplarındaki görünümün yanıltıcı olduğu durumları belirtir.

Plağın temel prensibi

EMB agar hem seçici hem de ayırt edicidir. Eozin Y ve metilen mavisi boyaları birçok Gram pozitif mikroorganizmayı baskılar; bu nedenle besiyeri Gram negatif mikroorganizmaların üremesini destekler. Aynı boyalar gösterge işlevi de görür: bir mikroorganizma mevcut şekeri fermente edip bulunduğu bölgede yeterli miktarda asit ürettiğinde, koloni boyayı yoğun biçimde tutar ve koyu mordan mavi siyaha kadar değişen bir renk alır. Yoğun asit üretimiyle koloni yüzeyinde metalik yeşil bir yanardönerlik görülebilir. ASM'nin eozin metilen mavisi agar plakları protokolü, seçicilik ve ayırt ediciliğin bu birleşimini açıklar ve eğitim için referans fotoğraflar sunar.

Herhangi bir sonucu yorumlamadan önce bir ayrıntı önem taşır: hangi formülasyonun kullanıldığını kontrol edin. Daha eski Holt Harris Teague formülasyonu laktoz ve sakkaroz içerirken, Levine EMB yalnızca laktoz içerir. Serratia marcescens izolatlarının birçoğu gibi sakkarozu fermente eden ancak laktozu fermente etmeyen bir mikroorganizma, bu iki formülasyonda farklı görünebilir. EMB besiyerlerine ilişkin üretici belgeleri, bu formülasyon farkını açıkça belirtir. Sonuçla birlikte üreticiyi ve formülasyonu da deftere kaydedin.

Hazırlanmış, ekim yapılmamış EMB agar genellikle kırmızı kahverengi ile kırmızımsı mor arasındadır; bazen yeşilimsi bir ton veya ince çökelti içerebilir. Bu zemin rengi üreme değildir. Her değerlendirmeyi ekim yapılmamış bir plakla veya belgelenmiş başlangıç görünümüyle karşılaştırın. Eğitim protokolü aksini belirtmedikçe, ilk ekim plağını 35 ila 37 C'de yaklaşık 18 ila 24 saatlik aerobik inkübasyondan sonra değerlendirin. Uzatılmış inkübasyon, fermantasyonun görünümünü değiştirebilir.

Plak nasıl incelenir?

İki tür ışık kullanın. Önce plağı yansıyan veya eğik açıyla gelen ışık altında inceleyin ve eğin: metalik parlaklık yanardönerdir ve bakış açısına göre ortaya çıkabilir veya kaybolabilir. Ardından koloni rengini ve koyu merkezleri değerlendirmek için plağı içinden geçen ışıkla inceleyin. Birbirinden iyi ayrılmış kolonileri değerlendirin; çünkü yoğun üreme ve komşu koloniler, bölgesel asit birikimini değiştirerek rengi zayıflatabilir veya belirginleştirebilir. ASM görsel koleksiyonu bunu doğrudan gösterir: karışık kültürdeki E. coli, çevresindeki mikroorganizmalar asit ortamını değiştirdiği için beklenen parlaklığını kaybedebilir.

Uygulama izin verdiğinde kontrolleri de dahil edin. Yaygın bir eğitim kontrol setinde, mavi siyah renk ve metalik parlaklık fenotipi için E. coli ATCC 25922; renksiz fenotip için Salmonella Typhimurium ATCC 14028 veya Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 gibi fermantasyon yapmayan bir mikroorganizma; inhibisyon kontrolü için ise Enterococcus faecalis veya Staphylococcus aureus gibi Gram pozitif bir mikroorganizma bulunur. Bu kontroller, EMB besiyerleri için standart kalite kontrol tablolarında listelenmiştir. Pozitif kontrolde parlaklık yoksa, bilinmeyen mikroorganizmadan şüphelenmeden önce inkübasyonu, koloni yoğunluğunu veya formülasyonu sorgulayın.

Örnek plak atlası

Aşağıdaki plaklar oluşturulmuş illüstrasyonlardır; gerçek kültürlerin fotoğrafları değildir. Belirli bir suşun tam renk tonunu değil, aranması gereken örüntüyü gösterirler. Bunları ASM referans fotoğraflarıyla ve eğitim laboratuvarındaki gerçek plaklarla karşılaştırın.

Plak 1: EMB agarda Escherichia coli, laktozu güçlü biçimde fermente eden mikroorganizma

EMB agarda E. coli genellikle koyu mor ile mavi siyah arasındadır ve çoğu zaman koyu bir merkeze ve yoğun asit üretiminden kaynaklanan metalik yeşil parlaklığa sahiptir. Bu parlaklık, öğrencilerin aradığı meşhur bulgudur; ancak onu tanımlayıcı bir özellikten çok destekleyici kanıt olarak değerlendirin. Parlaklığın yoğunluğu suşa, inkübasyon süresine, koloni yoğunluğuna ve bakış açısına göre değişir. Parlaklığın olmaması E. coli'yi dışlamaz; parlaklık göstermeyen koyu bir koloni ise fermantasyon yapan başka birkaç mikroorganizmayı düşündürür. Sonraki çalışmalar için yoğun üreme olan bir bölgeyi değerlendirmek yerine, iyi izole edilmiş bir koloni seçin.

Plak 2: EMB agarda Klebsiella pneumoniae, mukoid ve fermantasyon yapan mikroorganizma

EMB agarda Klebsiella pneumoniae genellikle pembe mordan kahverengi mora kadar değişen tonlarda büyük, parlak, mukoid koloniler oluşturur. Kolonilerin merkezleri çoğu zaman koyudur; ancak genellikle güçlü bir metalik parlaklık görülmez. Enterobacter gibi fermantasyon yapan yakın akraba mikroorganizmalarda da benzer morfoloji görülür. Mukoid yapı ve koloni büyüklüğü değerlendirmenin bir parçasıdır: küçük ve yassı bir pembe koloninin yorumdaki ağırlığı, büyük, kubbemsi ve mukoid bir kolonininkinden farklıdır. E. coli'de olduğu gibi plak bir fermantasyon fenotipini düşündürür; tür düzeyinde adlandırma ise aşağıda açıklanan biyokimyasal doğrulamayı gerektirir.

Plak 3: EMB agarda Salmonella ve fermantasyon yapmayan diğer mikroorganizmalar, renksiz koloniler

EMB agarda Salmonella ve Shigella ile birçok Pseudomonas izolatı dahil, laktozu fermente etmeyen benzer mikroorganizmalar genellikle renksiz, yarı saydam veya soluk kehribar renkli koloniler halinde ürer. Bazı formülasyonlar ve koşullar hafif pembemsi bir ton oluşturabilir; bu nedenle soluk pembe bir koloni, otomatik olarak fermantasyon yapan bir mikroorganizma anlamına gelmez. EMB, Salmonella'yı Shigella'dan veya fermantasyon yapmayan diğer mikroorganizmalardan ayırt etmez; bu ayrım sonraki testlerle yapılır. E. coli'ye benzer metalik koloniler oluşturan laktoz pozitif Salmonella suşlarının da belgelendiğini unutmayın. Bu, tek bir plağın kesin sonuca ulaşmak için yeterli olmamasının bir başka nedenidir.

Plak 4: Serratia marcescens ve formülasyon tuzağı

Serratia marcescens ayrı bir bölümü hak eder; çünkü öğrenciler çoğu zaman kırmızı koloniler bekler ve ardından plağı yanlış yorumlar. Klinik izolatların çoğu laktozu fermente etmez; bu nedenle Levine EMB'de genellikle soluk veya zayıf renklenmiş görünürler. Birçok izolat sakkarozu fermente ettiği için, sakkaroz içeren bir formülasyon daha koyu veya asit üretimiyle daha belirgin ilişkili bir reaksiyon verebilir. 35 ila 37 C'de klasik kırmızı prodigiosin pigmentini de beklemeyin; inkübatör sıcaklığında pigment üretimi güvenilir değildir. Protokolde EMB agarda Serratia marcescens adı geçtiğinde, ifadenin hangi formülasyonu varsaydığını kontrol edin. Serratia metabolizmasına ilişkin bir derleme, bu tuzağın arkasındaki laktoz negatif ve sakkaroz açısından değişken örüntüyü özetler.

Plak 5: kontroller ve inhibe edilen mikroorganizmalar

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus ve Bacillus gibi Gram pozitif mikroorganizmalar, EMB agarda genellikle inhibe edilir veya üremeleri belirgin biçimde baskılanır; ancak inhibisyon her suş için mutlak değildir. Bir kontrol paneli, değerlendirmenin sağlam bir temele dayanmasını sağlar: E. coli kontrolü mavi siyah renk ve parlaklıkla birlikte iyi üreme göstermeli, fermantasyon yapmayan mikroorganizma kontrolü renksiz üreme göstermeli, inhibisyon kontrolünde ise çok az üreme olmalı veya hiç üreme olmamalıdır. İnhibisyon kontrolü iyi ürerse, seçicilik işlevi başarısız olmuş demektir ve o partideki diğer tüm değerlendirmeler şüphelidir. Boyama yöntemleri, kültür besiyerlerinden farklı bir soruyu yanıtlar; laboratuvarda lam boyama konusuyla ilgili olarak metilen mavisi boyama atlasına bakın.

Sınırları belirlenmiş karşılaştırma

Yanıltıcı görünümler üç cümlede özetlenebilir. Koyu renk E. coli anlamına gelmez; çünkü Klebsiella, Enterobacter ve fermantasyon yapan diğer mikroorganizmalar, parlaklık olmadan koyu merkezler oluşturabilir. Pembe renk Klebsiella anlamına gelmez; çünkü orta düzeyde veya yavaş fermantasyon yapan mikroorganizmalar ve fermantasyon yapmadığı kabul edilen bazı mikroorganizmalar pembe veya lavanta renginde görünebilir. Parlaklık, kesin olarak E. coli anlamına gelmez; çünkü fermantasyonu güçlü olan başka mikroorganizmalar da bunu oluşturabilir. Eğitim protokolü ve karışık kültür görselleri, bu çıkarım hatalarının her birini gösterir.

Doğrulamanın sınırları

EMB agar bir türü değil, bir fenotipi gösterir. Farklı mikroorganizmalar aynı koloni görünümünü paylaşabilir; aynı mikroorganizma da suşa, yaşa, koloni yoğunluğuna, formülasyona ve inkübasyona bağlı olarak ders kitabındaki görünümünden sapabilir. Bu nedenle eğitim ve klinik iş akışlarında EMB morfolojisi ön tanımlama bulgusu olarak değerlendirilir.

Bir öğrenci için kanıtlarla desteklenebilir iş akışı şöyledir: izole koloniyi tanımlayın (büyüklük, renk, merkez, eğik ışık altında parlaklık, mukoid özellik), formülasyonu, inkübasyon süresini ve sıcaklığını ve kontrolleri kaydedin; ardından herhangi bir doğrulama testinden önce iyi izole edilmiş bir koloniden alt kültür yaparak saf kültür elde edin. Yaygın sonraki incelemeler arasında E. coli ve koliformların ön tanımlaması için Gram boyama ve IMViC reaksiyonları; enterik mikroorganizmalar için TSI veya KIA ve mikroorganizmaya özgü biyokimyasal paneller bulunur. Çalışma gerektirdiğinde serolojik yöntemler, MALDI TOF veya diğer valide edilmiş tanımlama yöntemleri kullanılır. EMB'nin seçici ve ayırt edici enterik besiyerleri arasındaki yeri hakkında temel bilgi için enterik kültür besiyerlerine giriş kaynaklarına ve Gram boyamayla sonraki incelemeye bakın. Mavi bir lam boyasının neyi kanıtlayıp neyi kanıtlayamayacağıyla ilgili bağlantılı soruda ise metilen mavisi boyama atlası, aynı yaklaşımla gözlemi sonuçtan ayrı tutar.

Sonuçtan önce gözlemi yazın. "Levine EMB'de 24 saatte, bakış açısına bağlı yeşil parlaklık gösteren koyu mavi siyah koloniler; güçlü laktoz fermantasyonuyla uyumlu" ifadesi kanıtlarla desteklenebilir. "E. coli, doğrulandı" ifadesi ise plağın tek başına sağlayamayacağı doğrulama adımını gerektirir.