Paul Ehrlich at methylene blue: kung paano nakatulong ang isang tina sa paghubog ng pagtuklas ng gamot

Ang ambag ni Paul Ehrlich sa medisina ay hindi isang gamot. Isa itong pangangatwiran tungkol sa kung paano susuriin ang isang gamot.

Noong 1878, nagsumite siya ng tesis para sa doktorado na ang pambungad na seksiyon ay pinamagatang "Ang Kemikal na Pag-unawa sa Pagkukulay." Ipinangangatwiran nito na iisa ang lohika ng pagkukulay sa isang hiwa ng tisyu at pagtitina sa isang piraso ng tela. Sa pareho, kumakapit ang kulay dahil sa kemikal na pagkakaakit sa pagitan ng tina at ng materyal, hindi dahil sumisipsip ang tisyu, mamantika ito, o may hugis itong nakakakulong ng pigmento. Lumaki si Ehrlich na pinapanood ang kanyang pinsang patologo na si Karl Weigert na naghahanda ng mga kinulayang hiwa ng tisyu, at ang pumukaw sa kanyang pansin ay hindi ang mga larawan kundi ang katotohanang pinipili ng tina kung saan ito pupunta.

Mukhang payak ang pahayag. Hindi ito ganoon. Kung kumakapit ang isang tina sa tisyu dahil sa mga kemikal na dahilan, ang padron ng pagkukulay ay isang ulat tungkol sa kimika ng tisyu. Ang isang kinulayang slide ay hindi na basta ilustrasyon kundi isang pagsukat.

Agad niya itong pinalawak. Noong 1880, pinagsama niya ang methylene blue at acid fuchsin at tinawag ang halo na neutral na pangkulay, isang neutralen Farbkörper, na nakapagbukod sa iba't ibang uri ng puting selula ng dugo na hindi maibukod ng mga tinang ginagamit nang paisa-isa noon. Pagkaraan ng dalawang taon, inilahad niya ang isang pamamaraan ng pagkukulay sa mga bacillus ng tuberkulosis gamit ang methyl violet, at ginamit ni Koch ang pamamaraan sa sarili niyang gawain.

Hiwalay na usapin ang teoryang kalaunang nagbigay ng iisang pundasyon sa mga gawaing ito, at madalas na napapasimple ang petsa nito. Ang teorya ni Ehrlich tungkol sa side chain, ang ideyang kumikilos ang isang sangkap sa isang selula dahil magkatugma ang kanilang kimika, ay mula sa dekada 1890, hindi sa mga taon ng kanyang pag-aaral sa tina. Ang naibigay ng mas naunang gawain ay ang paniniwalang nauna rito: kemikal ang pagiging mapili, kaya maaari itong sadyang hanapin sa halip na matuklasan lamang nang nagkataon.

Ang eksperimentong gumawa sa tina bilang isang mapa

Noong 1885, naglathala si Ehrlich ng isang monograpiya tungkol sa mga pangangailangan ng organismo sa oxygen, na may subtitulong isang pag-aaral na nagsusuri sa pamamagitan ng kulay. Ang pamamaraan nito ay mag-iniksyon ng mga tinang ang kulay ay nakadepende sa estado ng oksidasyon, saka ihambing kung paano nire-reduce o pinananatili ng iba't ibang organo ang mga ito. Ginagamit ang tina bilang instrumento, gaya ng paggamit sa isang termometro: nag-uulat ito tungkol sa mga kalagayan sa loob ng tisyu na hindi direktang masusuri. Sa sariling pahayag ni Ehrlich, ang layunin ay tukuyin, sa tulong ng mga partikular na tina, ang kakayahang mag-reduce ng mga buhay na organo.

Lumabas ang resulta para sa methylene blue noong 1886, sa isang artikulo tungkol sa reaksiyon ng tina sa buhay na materyal ng sistemang nerbiyos, na binasa sa isang samahang medikal noong nakaraang Disyembre. Ipinasok ang methylene blue sa sirkulasyon ng isang buhay na hayop, at pagkatapos ay kumuha ng maninipis na hiwa ng tisyu at inilantad ang mga ito sa hangin upang muling ma-oxidize at maging asul ang naipong tinang walang kulay, at maipakita kung saan ito naipon. Kumapit ang kulay sa mga selula at hibla ng nerbiyos, at sapat ang pagiging mapili nito upang maging pamantayang pamamaraan ang teknik sa pagpapakita ng tisyu ng nerbiyos. Hindi na lamang ang compound isang pangkulay na inilalagay sa isang patay na hiwa ng tisyu sa mesa ng laboratoryo. Isa na itong panandang kusang kumakalat sa loob ng buhay na katawan, at maaaring basahin ang pagkakabahagi nito.

Dapat malinaw na sabihin ang katangiang nasa likod ng dalawang eksperimento, dahil nakasalalay rito ang lahat ng iba pa sa kuwentong ito. Nababaligtad ang pagbabagong kemikal ng methylene blue. Ang reduced form nito, ang leucomethylene blue, ay walang kulay, at kapag nadikit sa oxygen ay bumabalik ito sa asul na kation. Walang kulay ang solusyon ng tina na may glucose sa isang nakasarang garapon; buksan ang garapon at nagiging asul ito. Iniulat na tuwirang ipinakita ni Ehrlich ang puntong ito sa pamamagitan ng paglalagay ng iron chloride sa mga kinulayang hiwa ng tisyu, bukod sa paglalantad sa hangin, at pagmamasid sa pagbabalik ng kulay. Ang isang tinang nagbabago ng kulay ayon sa estadong redox ng kapaligiran nito ay isang kasangkapan sa pagsisiyasat sa kapaligirang iyon.

Kaya magkatabi ang dalawang katangian. Kayang pag-ibahin ng isang tina ang isang tisyu mula sa iba. At maaaring lumitaw o mawala ang kulay ng isang tina dahil sa pagbabago sa estado ng oksidasyon.

Kapag tiningnan mula sa mga sumunod na pangyayari, ang ikalawang katangian ang simula ng kemoterapiya. Kung kumakapit ang isang compound sa isang uri ng tisyu at hindi sa iba, maaaring makarating din ang parehong compound sa isang uri ng organismo at hindi sa iba. Tuwirang sinabi ni Ehrlich ang hinuha: kung maaaring piliing kulayan ang isang patoheno, maaaring nagpapahiwatig ang pagkukulay ng partikular na pinsala sa patohenong iyon. Samakatuwid, maaaring magamit ang isang tina bilang gamot, na nakatuon sa sumasalakay na organismo sa halip na sa pasyente.

Hindi para sa malaria ang unang pagsubok sa isang pasyente. Noong 1890, kasama ang sikiyatrang si Arthur Leppmann, iniulat ni Ehrlich na napawi ng methylene blue ang pananakit na kaugnay ng neuralhiya at rayuma sa mga kalamnan, kasukasuan at litid. Pinag-usapan ng dalawa kung maaaring kumilos ang gamot sa sakit sa pag-iisip at nagpasyang huwag itong subukan. Gayunman, itinuloy ito ng isang Italyanong manggagamot, si Pietro Bodoni ng Genoa. Ang pamagat ng kanyang artikulo noong 1899 ay tumutukoy sa pagkilos bilang pampakalma sa iba't ibang anyo ng sikosis: inilarawan niya ang pagkalma ng labing-apat na balisang pasyente, at binanggit na ginagamit na rin ng ibang mga doktor sa Genoa ang tina para sa parehong layunin. Ang pagpapakalma ay hindi isang epekto sa mismong sakit, at paulit-ulit na lumilitaw ang pagkakaibang iyon sa kasaysayang ito.

Dumating ang pag-aaral sa malaria noong 1891, kasama ang patologo na si Paul Guttmann, sa ospital ng Moabit sa Berlin. Ibinigay ang methylene blue sa dalawang pasyente, at lumabas ang ulat sa Berliner klinische Wochenschrift noong 28 Setyembre 1891. Sa unang kaso, ininom ng pasyente ang 0.5 g ng tina nang minsanan noong gabi ng 29 Hunyo; hindi lubusang naganap ang inaasahang pag-atake, at ang tanging reklamong naitala pagkatapos ay bahagyang masakit at mahirap na pag-ihi na may asul na ihi. Nawala ang mga pag-atake ng lagnat sa mga unang araw, at wala na ang mga parasito sa dugo pagsapit, sa pinakahuli, ng ikawalong araw. Sa sariling buod ng mga may-akda, ganap na natupad ang kanilang mga inaasahan. Hindi sapat na patunay ang dalawang kasong walang kontrol. Ang mas buong salaysay tungkol sa methylene blue at malaria, kasama ang mga makabagong pagsubok, ay nasa sarili nitong pahina, at mas makitid ang mahalagang tanong dito: gaano karami sa pangangatwiran ni Ehrlich ang nanatiling wasto nang masubok sa parasito.

Saan naging tama ang pangangatwiran at saan ito pumalya

Kaunti lamang sa mekanismo ang nanatiling wasto, kahit man lamang sa anyong iminungkahi ni Ehrlich. Hindi umaayon sa Plasmodium ang maayos na paliwanag na ang isang patag na kation na may tatlong singsing ay sumisingit sa pagitan ng mga pares ng base sa DNA ng parasito. Napakadaling ma-reduce ng methylene blue sa isang nahawaang pulang selula ng dugo, kaya hindi man lamang ito dumarating sa parasito bilang patag na kation, at ang paliwanag tungkol sa pagsingit sa DNA na angkop sa mga tinang acridine ay hindi angkop dito.

Mas masalimuot ang sinusuportahan ng ebidensiya. Hinahadlangan ng methylene blue ang glutathione reductase ng parasito sa mga konsentrasyong maaaring maabot sa isang pasyente. Hinaharangan nito ang pagbabago ng haem tungo sa haemozoin, ang hindi reaktibong pigmentong ginagawa ng parasito upang hindi ito malason ng sarili nitong pagtunaw ng haemoglobin, nang halos kasingbisa ng chloroquine at higit na mas mabisa kaysa quinine. Lumilikha rin ang paulit-ulit nitong siklong redox ng mga reaktibong anyo ng oxygen sa isang selulang gumagawa na ng mga ito. Hindi pa tiyak kung alin sa mga ito ang tunay na mekanismo, o kung nakikibahagi ang lahat.

May isa pang komplikasyon, at dapat itong maging batayan sa pagbasa ng anumang makasaysayang pahayag tungkol sa compound na ito. Hindi iisang sangkap ang komersiyal na methylene blue noong panahong iyon. May azure B sa mga sample, ang kaugnay na compound na nabawasan ng isang methyl group, at mas marami nito ang naiipon sa mga lumang solusyon. Ang Azure B ay isang metakromatikong tina na may ibang mga target: kinukulayan nito nang madilim na asul ang DNA na may dalawang hibla at berde ang RNA. Ang halo ng dalawang tina na may magkaibang pinupuntahan, sa mga proporsiyong walang sinumang nagtala, ay hindi makasuporta sa isang malinaw na pahayag tungkol sa ginawa ng methylene blue na nasa halo.

Hindi kailanman napalitan ng tina mismo ang quinine. Mas naging matagumpay ang pamamaraan. Patuloy na itinaguyod ng estudyante ni Ehrlich na si Wilhelm Roehl, na nagtatrabaho sa pinagsamang kompanya ng tina at gamot na IG Farben, ang mga deribatibo ng tina bilang mga gamot para sa mga sakit sa tropiko at ibinigay ang nawawalang kasangkapan: ang kanaryo, na nahawahan ng malaria ng ibon, bilang karaniwang panala sa mga kandidatong compound. Pagkatapos, binago ni Werner Schulemann ang side chain, at napagaling ng nabuong asin ng phenothiazinium ang impeksiyon sa eksperimento. Ginagawa pa rin nitong asul ang mga pasyente.

Lumalabas na ang pangmatagalang bunga ay hindi ang tina ni ang sistema ng mga singsing kundi ang side chain. Binago ng pagdaragdag ng isang grupong dialkylaminoalkylamino ang asal ng molekula, at nanatili ang bahaging iyon sa bawat sumunod na muling pagdisenyo. Panatilihin ang grupong iyon at palitan ang singsing na phenothiazinium ng acridine, at quinacrine ang kalalabasan. Ipalit ang quinoline, at chloroquine ang kalalabasan. Taglay rin ng pamaquine, primaquine at amodiaquine, na pawang nasa talaan pa rin ng mga gamot laban sa malaria, ang parehong grupo. Ang compound na pumalya bilang paggamot ang nagbigay ng bahaging nagtagumpay.

Dumaraan sa singsing, sa halip na sa gamot, ang ugnayan sa mga antipsikotiko. Ang paglilinaw sa estruktura ng methylene blue ang nagdala kay Heinrich August Bernthsen sa pangunahing nukleo ng phenothiazine noong 1883, at ang batayang estrukturang iyon, na binago sa iba't ibang paraan, ang pinag-aaralan ng mga kimiko sa Rhône-Poulenc noong dekada 1940 habang naghahanap ng mga antihistamine. Na-synthesize ang isa sa mga compound na iyon bandang katapusan ng 1950 at sinubukan ng siruhanong si Henri Laborit, na nakapansing nagiging kalmado at walang pakialam ang mga pasyente dahil dito. Noong Enero 1952 lumabas ang unang nalathalang paggamit nito sa sikiyatriya, sa isang pasyenteng may mania. Ang unang antipsikotiko ay hindi gaanong inapo ng gamot ni Ehrlich laban sa malaria kundi isang malayong kamag-anak ng tinang sinimulan niya.

Tatlong gawi mula sa pangyayaring ito na sulit panatilihin

1. Ang "unang sintetikong gamot na ginamit sa medisina" ay naglalarawan ng isang kategorya, at mas malawak ang mga kundisyon nito kaysa sa ipinahihiwatig ng parirala. Naging nakagawiang pahayag na ang pariralang ito; tinatawag ng isang madalas sipiing rebyu nina Schirmer at mga kasamahan sa Neurobiology of Aging ang methylene blue na pinakaunang ganap na sintetikong gamot na ginamit sa medisina. Ipinakilala ang chloral hydrate bilang sintetikong pampakalma noong 1869, mahigit dalawampung taon na mas maaga. Ang artikulo mismo noong 1891 ay nagbibigay ng bahagi ng sagot, dahil pinangalanan ng mga may-akda nito ang mga sintetikong pampababa ng lagnat na pumalya na laban sa malaria, kabilang ang quinoline, antipyrine at antifebrin. Mas huli pa ang sariling gamot ni Ehrlich na may arsenic para sa sipilis. Ang maipagtatanggol na bersiyon ng pahayag ay tungkol sa pamamaraan sa halip na sa pagiging una: kabilang ang methylene blue sa mga pinakaunang sintetikong compound na piniling kumilos laban sa isang partikular na organismo batay sa isang kemikal na teorya ng pagiging mapili.
2. Ang piling pamamahagi ay hindi katumbas ng piling pakinabang. Ang resulta ni Ehrlich noong 1886 ay napupunta ang tina sa tisyu ng nerbiyos. Magkaibang pagsukat ang kung saan napupunta ang isang compound at kung ano ang ginagawa nito pagdating doon, at mas madaling sukatin ang una. Sa puwang na iyon nakasandig mula noon ang karamihan sa mga pahayag tungkol sa methylene blue at sa utak.
3. Ang kadalisayan ay bahagi ng ebidensiya, hindi ng pagmemerkado. Malabo ang makasaysayang rekord dahil mismo rito. Binabago ng maliliit na pagkakaiba sa estruktura kung saan napupunta ang compound na ito, kaya kailangang iugnay ang isang sertipiko ng pagsusuri sa isang partikular na lot sa halip na ihain bilang simpleng pahayag na sinuri ang isang produkto. Ang nagbebentang nagsasabing sumusunod ito sa monograpiya ng farmakopeya habang mga heavy metal lamang ang sinusuri ay nag-aangkin nang higit sa sinusuportahan ng ulat. Kinukuha ng Blupreme ang methylene blue mula sa isang tagagawa ng mga produktong parmasyutiko at sinusuri ang buong espesipikasyong itinakda ng monograpiya: pagkakakilanlan, kadalisayan, mga organikong impurity, natitirang mga solvent, mga elemental na impurity, latak matapos sunugin, mga limitasyon sa mikrobyo at mga endotoxin ng bakterya. Inilalathala ang ulat kasabay ng produkto, at ipinapaliwanag sa pahina ng methylene blue na gradong USP ang mga limitasyong iyon at kung bakit ang resulta para sa azure B ang unang dapat hanapin.

Mga sanggunian ayon sa petsa

Ang sunod-sunod na mahahalagang pangyayari ayon sa petsa, kabilang ang kimika ng tina na nauna kay Ehrlich at ang mga grado at espesipikasyong sumunod sa kanya, ay hiwalay na inilalahad sa kasaysayan ng methylene blue, at ang pagkakakilanlan mismo ng compound ay tinatalakay sa kung ano ang methylene blue.

Hindi magkakapantay na ebidensiya ang mga larawang pinagbabatayan ng salaysay na ito, na muling inilathala sa rebyu noong 2012 nina Krafts, Hempelmann at Skórska-Stania, at ipinapakita ng isang halimbawa kung bakit. Ang larawang mula noong 1891 ang pangunahing rekord ng pagsubok; ang larawang-potograpiya ng tao mula noong 1910 na katabi nito ay nagtatakda lamang ng petsa ng isang reputasyon at wala nang iba. Ang mga pahina mula sa kuwaderno ni Andersag noong 1934 ang tuwirang bakas ng pagpapalit gamit ang quinoline, sa sariling sulat-kamay ng kimiko.

Ang tapat na buod ng mga eksperimento ni Ehrlich sa tina ay tama siya tungkol sa pagiging mapili at sa target, ngunit mali siya tungkol sa mekanismo. Talagang naiipon ang methylene blue sa tisyu ng nerbiyos at talagang nakapipinsala ito sa parasito ng malaria. Hindi nito ginagawa ang ikalawa dahil sa una, at mali ang kemikal na dahilang ibinigay niya para sa pareho. Ang napatunayan niya nang walang pag-aalinlangan ay mas pangmatagalan kaysa sa isang tamang mekanismo: maaaring piliin ang isang compound sa halip na basta matagpuan, at piliin ito batay sa ebidensiyang nakalap bago pa ito ibigay ng sinuman sa isang pasyente.