Paglamlam gamit ang methylene blue: mga pamamaraan sa mikroskopiya at atlas ng mga tunay na larawan

Ang paglamlam gamit ang methylene blue ay nagpapadali sa pagkilala sa mga katangian ng selula na kung wala ito ay malabo sa mikroskopiyang may maliwanag na larangan. Makatutulong ito sa mga mag-aaral na mahanap ang nukleo ng isang selula mula sa pisngi o suriin ang hugis at pagkakaayos ng mga mikroorganismo. Gayunman, ang isang asul na bagay ay isang obserbasyon. Ang pagtukoy sa pangalan ng organismo, pagsukat dito, at pagpapasya kung nagpapahiwatig ito ng sakit ay magkakahiwalay na gawain.

Ipinakikita ng larawan sa pabalat ang prinsipyo ng kontrast. Ang atlas sa ibaba ay naglalaman ng mga tunay na larawan mula sa mga ispesimeng may magkakahiwalay na dokumentasyon, kasama ang impormasyon tungkol sa orihinal nilang pinagmulan.

Ano ang ipinakikita ng methylene blue?

Ang methylene blue ay isang basikong tina: may positibong karga ang ion nitong may kulay. Gaya ng paliwanag ng OpenStax sa talakayan nito tungkol sa paglamlam ng mga ispesimen, nakikipag-ugnayan ang mga basikong tina sa materyal ng selula na may negatibong karga at maaaring magpalitaw sa mga selula laban sa mas mapusyaw na likuran. Sa angkop na mga preparasyon, pinatingkad ng methylene blue ang mga bahaging mayaman sa nucleic acid at iba pang estrukturang kumakapit sa panglamlam.

Sa simpleng paglamlam, iisang tina ang nagbibigay ng kontrast. Dahil dito, maaaring magmukhang asul ang iba't ibang organismo kahit hindi sila iisang uri ng organismo. Sa simula, ang mga kapaki-pakinabang na tanong ay mapaglarawan: bilog ba o pahaba ang mga bagay, magkakahiwalay o magkakakumpol, pantay ang pagkakalamlam o may magkakaibang bahagi sa loob? Tingnan ang pagkakaiba ng simpleng paglamlam at paglamlam na Gram bago ituring ang kulay bilang resulta ng pag-uuri.

Magkaiba ang kontrast at resolusyon. Tumutulong ang kontrast na maihiwalay sa paningin ang isang bagay mula sa paligid nito; pinag-iiba naman ng resolusyon ang magkakalapit na detalye. Hindi garantiya ang mas madilim na larawan na mas malinaw na maihihiwalay ang mga estruktura. Hindi rin dapat tawaging organelo ang bawat maitim na butil.

Mga preparasyong walang panglamlam, nilamlamang basang preparasyon, at mga pahid

Ang basang preparasyong walang panglamlam, o katutubo, ay nagpapanatili ng tanaw na walang idinagdag na tina, bagaman binabago pa rin ang ispesimen ng pag-alis dito mula sa orihinal nitong kapaligiran. Sa nilamlamang basang preparasyon, nagdaragdag ng reagent habang nananatili sa likido ang materyal sa ilalim ng takip na salamin. Sa pahid na pinirmi, ikinakalat ang materyal sa slide at ginagamit ang isang itinakdang paraan ng pagpirmi bago ang kasunod na pagproseso. Inihihiwalay ng pangkalahatang paliwanag ng OpenStax tungkol sa paghahanda ang mga basang preparasyon sa pagpirmi at ipinapaliwanag kung bakit hindi na maipakikita ng mga organismong pinirmi ang normal na paggalaw o metabolismo.

Magkakaibang tanong ang sinasagot ng mga preparasyong ito:

Para sa paghahambing sa klase, itala ang preparasyong walang panglamlam bago suriin ang isang hiwalay na nilamlamang preparasyon na ginawa ayon sa protokol ng pagtuturo. Panatilihing maihahambing ang liwanag at mga setting sa pagkuha ng larawan. Kung dalawang magkaibang selula ang kinunan, ilarawan ang mga ito bilang mga halimbawa, hindi bilang tala ng iisang selula bago at pagkatapos lamlaman.

Atlas ng mikroskopiya: tatlong tunay na nilamlamang ispesimen

Ang atlas na ito ay isang orihinal na pagpili at interpretasyon ng tatlong mikropotograpiyang may bukas na lisensiya. Ang mga may-akda ng pinagmulan ang tumutukoy sa mga ispesimen at panglamlam. Hindi namin independiyenteng napatunayan ang kanilang mga ispesimen. Inilathala muli ang mga larawan nang hindi pinuputol, bilang mga WebP na conversion na walang pagkawala ng datos, nang walang idinagdag na katangian o pagbabago sa kulay.

Larawan 1: mga selula mula sa pisngi ng tao

Ispesimen: mga selula mula sa pisngi ng tao. Panglamlam: methylene blue. Pagpapalaki: 400×, ayon sa potograpo. Panukat na guhit: hindi makukuha; walang ibinigay na nakalibrang sukat ng pixel ang pinagmulan. Larawan ni Fritzmann2002, 2017, mula sa Mga Selula Mula sa Pisngi ng Tao (Paglamlam gamit ang Methylene Blue), na may lisensiyang CC BY-SA 4.0. Pinananatili ng muling paglalathalang ito ang lisensiyang iyon.

Magsimula sa isang nakahiwalay na selula: mas madaling makilala ang mas madilim nitong nukleo mula sa nakapaligid na asul na sitoplasma. Pagkatapos, suriin ang magkakapatong na selula sa ibaba nito. Pinahihirap ng pagkakapatong ang pagsunod sa hangganan at maaari itong lumikha ng mas madilim na bahagi sa isang lugar. Gamitin ang larawang ito upang magsanay sa pagsubaybay sa mga balangkas, hindi upang bilangin bilang nukleo ang bawat maitim na bahagi. Pinalalawak ng gabay sa pagmamasid sa mga selula mula sa pisngi ang pagsasanay na angkop sa partikular na sampol.

Larawan 2: mga selula ng sibuyas

Ispesimen: mga selula ng sibuyas, ayon sa pagkilala ng pinagmulan. Panglamlam: methylene blue. Pagpapalaki: lumilitaw ang “200x” sa orihinal na pangalan ng file; hindi ito independiyenteng napatunayan. Panukat na guhit: hindi makukuha; walang ibinigay na kalibrasyon. Larawan ni Alvy16, 2019, mula sa Selula ng sibuyas 200x, na may lisensiyang CC BY 4.0.

Bumubuo ang mga pahabang kompartimento ng isang maayos na sapin. Ihambing ang mahahabang hangganang pinagsasaluhan nila sa mga hindi regular na balangkas sa Larawan 1. Pansinin din ang kapansin-pansing maitim na materyal at hindi pantay na liwanag ng larangan. Hindi natitiyak ng larawan ang pagkakakilanlan ng bawat maitim na deposito. Ipinakikita nito kung bakit kasama sa kapaki-pakinabang na tala ng obserbasyon ang mga artipakto at kawalang-katiyakan, sa halip na lagyan ng pangalan ang lahat ng sumisipsip ng kulay.

Larawan 3: lebadurang kinilala ng pinagmulan bilang Candida spp.

Ispesimen: Candida spp., ayon sa potograpo. Panglamlam: simpleng positibong paglamlam gamit ang methylene blue. Pagpapalaki: hindi makukuha. Panukat na guhit: hindi makukuha; walang ibinigay na nakalibrang sukat ng pixel. Larawan ni Marta, gumagamit ng Wikimedia na si Martunia.g, 2021, mula sa Positibong paglamlam gamit ang methylene blue 2, na may lisensiyang CC BY 4.0.

Ihambing ang mga siksik na asul na kumpol sa mga gilid na hindi gaanong siksikan. Mas madaling sundan ang magkakahiwalay na balangkas kung saan mas kaunti ang pagkakapatong ng mga bagay. Ang pangalang Candida ay nagmula sa tala ng pinagmulan, hindi sa pagtukoy ng espesye na isinagawa batay sa larawang ito. Wala ring ibinibigay na resulta tungkol sa kakayahang mabuhay ang larawang ito. Nangangailangan ang mga pagsusuri sa kakayahang mabuhay at respirasyon ng lebadura ng sarili nilang mga kondisyon, kontrol, at interpretasyon.

Tamang pagbasa sa iskala

Maaaring gamitin ang mga larawang ito para sa biswal na paghahambing, hindi para sa pagsukat sa mikrometro o paghahambing ng aktuwal na laki ng mga selula sa iba't ibang larawan. Hindi naibabalik ng iniulat na pagpapalaki ang nawawalang kalibrasyon ng kamera. Binabago ng pagpapalit sa laki ng pagpapakita ng larawan ang nakikitang pagpapalaki nito.

Para sa sarili mong mga larawan, magtakda ng kalibrasyon sa pagsukat gamit ang isang kilalang pamantayan at ang kaugnay na kaayusang optikal. Ipinapaliwanag ng gabay ng Nikon sa mikrometriya kung paano ginagawang pisikal na haba ng isang stage micrometer ang mga di-tiyak na dibisyon sa larawan o reticle. Itala ang lente ng obhetibo, konpigurasyon ng kamera, at kalibrasyon, at magdagdag ng panukat na guhit mula sa mga datos na iyon. Huwag tantiyahin ang guhit mula sa karaniwang laki ng selula na nakasaad sa isang aklat-aralin.

Angkop ba ang nasa bote sa pamamaraan?

Ang boteng may etiketa na methylene blue ay hindi kumpletong espesipikasyon para sa laboratoryo. Suriin ang konsentrasyon at mga yunit nito, solvent, mga karagdagang sangkap, nilalayong gamit, dokumentasyon ng batch, at mga tagubilin. Inilalarawan ng talaan ng datos sa kaligtasan ng isang reagent ang mga panganib; itinatakda naman ng mga tagubilin ng pamamaraan kung paano ito gagamitin para sa nilalayong preparasyon.

Isang kongkretong halimbawa ang solusyon ng methylene blue ni Löffler mula sa Merck. Kinikilala ito ng tagagawa bilang reagent para sa mikroskopiya at inilalarawan ang papel nito bilang panglamlam na panalungat sa acid-fast na paglamlam. Ipinakikita rin ng nakatalang kakayahan nitong magliyab kung bakit hindi sapat ang impormasyong “isang asul na likido” para sa pagpaplano ng paghawak o pag-init. Ang mga katangiang iyon ay para sa pormulasyong iyon, at hindi awtomatikong para sa lahat ng solusyon ng methylene blue sa tubig.

Gayundin, ang eosin methylene blue agar ay isang pormuladong midyum para sa pagkultura. Hindi ito panglamlam ng slide na ginagawa sa pagdaragdag ng purong methylene blue sa isang ispesimen. Para sa ibang layunin sa pagkuha ng larawan, ihambing ang mga alternatibo sa methylene blue para sa mikroskopiya.

Para sa isang kit ng mikroskopyo para sa baguhan, magsimula sa dokumentadong pamamaraang pang-edukasyon nito, mga inihandang slide na kilala ang nilalaman, at ang itinakdang reagent. Kung nawala ang etiketa ng bote o hindi matiyak ang komposisyon nito, palitan ito ng angkop na reagent na may dokumentasyon. Gumamit ng proteksiyon sa mata at sundin ang mga tagubilin sa paghawak na ibinigay para sa aktuwal na pormulasyon. Ang materyal mula sa tao at mga hindi kilalang sampol mula sa kapaligiran ay nangangailangan ng mga pamamaraan ng laboratoryong panturo para sa paghawak at pagtatapon ng sampol; hindi kapalit ng mga pamamaraang iyon ang paglamlam.

Isulat ang obserbasyon bago ang konklusyon

Ang “mga asul na bagay na hugis-itlog at magkakakumpol” ay isang mapangangatwirang paglalarawan ng larawan. Nangangailangan ang “isang partikular na impeksiyon” ng ebidensiyang hindi ibinigay ng larawan. Panatilihing magkahiwalay sa kuwaderno ang pinagmulan ng ispesimen, paghahanda, reaksiyon sa paglamlam, at paraan ng pagkilala. Ginagawang kapaki-pakinabang ng pagkakaibang iyon ang isang simpleng larawan sa klase at pinipigilan nitong magdala ang isang kaakit-akit na mikropotograpiya ng pahayag na hindi nito kayang suportahan.