Paano pumapasok ang methylene blue sa mga selula: reduksiyon, muling oksidasyon, at partisyon sa membrana

Panoorin ang isang sisidlan ng mga selulang endoteliyal habang sumisipsip ang mga ito ng methylene blue, at ang pinakahalatang interpretasyon ay siya ring mali. Nawawala ang asul na kulay ng medium at nagkakaroon ng mga asul na granula ang mga selula, kaya tila tumawid ang tina sa membrana bilang asul na molekula. Iba ang sinasabi ng mga eksperimento. Halos hindi tumatawid ang asul na anyo. Ang walang-kulay na anyo ang tumatawid, at ang asul na nakikita mo sa loob ay nabubuo roon pagkatapos nitong makarating.

Mahalaga ang pagbabaligtad na ito dahil tinutukoy nito kung ano ang masasabi at hindi masasabi ng paglamlam. Ipinapakita ng mga asul na granula ang tina na muling naoksida at nakulong sa mga organelo. Hindi nila ipinapakita ang kabuuang tina sa selula, hindi nila ipinapakita ang bahaging nareduse, at hindi nila sinusukat ang biyolohikal na epekto. Upang maunawaan kung bakit, sundan ang tatlong hakbang: reduksiyon sa ibabaw, difusyon ng anyong nareduse, at muling oksidasyon at pagkulong sa loob.

Kumikilos ang dalawang anyo na parang magkaibang molekula

Ang naoksidang methylene blue ay isang patag na sistema ng mga singsing na may positibong karga. Natutunaw ito sa tubig, malakas na sumisipsip ng liwanag sa bandang 600 hanggang 700 nanometers, at mukhang asul. Ang karga ang mahalagang punto. Hindi madaling makalusot sa lipid na membrana ang isang molekulang may karga at may afinidad sa tubig, kaya ang maingat na pananalita sa literatura ay relatibong hindi nakatatagos sa membrana, hindi ganap na hindi nakatatagos.

Ang nareduse na methylene blue, na tinatawag na leucomethylene blue, ay walang kulay, walang karga, at natutunaw sa taba. Alisin ang karga at hindi na nagsisilbing pader ang membrana. Madaling tumatawid sa pamamagitan ng difusyon ang nareduse na molekula, at kapag nasa loob na ito ng isang kompartimentong mas nakapag-o-oksida, maaari itong muling mawalan ng mga elektron at bumalik sa asul, may-karga, at nakukulong na anyo. Samakatuwid, ang kimikang redox ng tina ay siya ring mekanismo ng transportasyon nito. Baguhin ang bilang ng mga elektron at mababago mo ang kakayahan nitong tumagos.

Ang mga elektron para sa unang hakbang ay nanggagaling mismo sa selula. Nagsasagawa ang mga selula ng mamalya ng transportasyon ng elektron sa plasma membrane, na naglilipat ng mga katumbas na panreduse mula sa mga donor sa loob ng selula palabas sa mga tagatanggap sa ibabaw. Ang aktibidad na ito sa magkabilang panig ng plasma membrane ay isang normal na tungkulin ng selula, na matatagpuan sa karamihan ng mga uri ng selula. Ang reductase sa ibabaw ng endoteliyo na kumikilos sa mga tinang thiazine ay katulad ng iba pang reductase sa isang mahalagang aspeto: patuloy itong gumagana sa presensiya ng cyanide at azide sa mga dosis na nagpapatigil sa mga kasunod na hakbang. Ang paghihiwalay na iyon ang susi sa buong paliwanag.

Nauna ang partisyon, at halos naipaliwanag nito ang pagsipsip

Noong 1929, nagtanong si Marian Irwin sa Rockefeller Institute ng isang mas simpleng tanong. Marahil ang pagpasok ng tina ay partisyon lamang sa pagitan ng tubig at ng mga patong na mataba sa selula, at maaaring katawanin ng isang patong ng chloroform ang mga patong na iyon sa laboratoryo. Sa kaniyang mga pag-aaral na spektropotometriko tungkol sa pagtagos, inalog ang mga solusyon ng tina sa tubig kasama ng chloroform at inihambing ang lumipat sa organikong phase sa pumasok sa mga buhay na selula ng algae.

Dalawang natuklasan sa gawaing iyon ang dapat pa ring pagtuunan ng pansin. Una, may trimethyl thionine, na tinatawag na ngayong Azure B, ang mga komersiyal na solusyon ng methylene blue. Mas mabilis tumagos ang impurity na ito kaysa sa methylene blue mismo, lalo na sa alkalinong pH kung saan nangingibabaw ang anyong free base na natutunaw sa lipid. Ang ilang tila pagpasok ng methylene blue ay talagang selektibong pagpasok ng Azure B. Ikalawa, itinakda ng pH ang kinalabasan sa pamamagitan ng pagtatakda ng estado ng ionisasyon, at mas maraming tina ang nakapasok sa mga napinsalang selula kaysa sa mga buo at hindi napinsala. Ang mga koepisyente ng partisyon at ang estado ng karga ang namahala sa dami ng nasipsip ng artipisyal na sistema at ng buhay na selula. Sinuportahan ng pagkakatulad ng dalawa ang ideya na may mga patong na hindi nakabatay sa tubig sa hangganan ng selula.

Nauna sa panahon ang modelo tungkol sa mga lipid at ionisasyon, ngunit hindi nito maibukod ang tinang nahahati sa mga phase nang hindi nagbabago mula sa tinang dumaraan sa kemikal na pagbabago sa ibabaw, tumatawid sa ibang anyo, at ibinabalik sa dating anyo sa loob. Nangailangan ang pagkakaibang iyon ng ibang eksperimento, at dumating ito makalipas ang pitumpung taon sa endoteliyo ng baga.

Reduksiyon sa labas, pagkulong sa loob

Gumamit si Merker at ang kaniyang mga kasamahan ng mga kinulturang selulang endoteliyal mula sa arterya ng baga ng baka at nagmungkahi ng sunod-sunod na tatlong hakbang: nirereduse sa ibabaw ng selula ang naoksidang tina tungo sa walang-kulay nitong anyong may afinidad sa lipid, pumapasok ang nareduse na anyo sa pamamagitan ng difusyon, at muling nalilikha sa loob ng selula ang naoksidang anyong hindi nakatatagos sa membrana, na naiipon doon. Pagkatapos, sinubok ng kanilang pag-aaral sa pagsipsip ng thiazine ng endoteliyo ang pagkakasunod-sunod na ito sa pamamagitan ng pagtatangkang putulin ito sa mga tiyak na hakbang.

Ang unang kasangkapan ay ferricyanide, isang tagatanggap ng elektron na hindi makapasok sa selula. Kapag nirereduse ng mga enzyme sa ibabaw ang asul na tina tungo sa walang-kulay nitong anyo sa labas ng selula, maaaring bawiin ng ferricyanide ang mga elektron na iyon, na muling bumubuo ng asul na tina sa medium bago pa ito makatawid. Hangga't may labis na ferricyanide (10 micromolar na tina kumpara sa 50 hanggang 500 micromolar na ferricyanide), halos huminto ang pagsipsip ng tina. Bumalik lamang ang pagsipsip sa normal nitong bilis nang maubos ang ferricyanide. Ipinakita ng kinetika ang parehong paliwanag sa isa pang paraan. Nawala ang ferricyanide sa halos hindi nagbabagong bilis, na naaayon sa tuloy-tuloy na daloy ng reduksiyon sa ibabaw na nagpapakain sa isang tagapamagitan na maaaring gamitin nang paulit-ulit. Samantala, eksponensiyal na nawala ang tina sa labas ng selula habang nauubos ang reserba nito. Ang tuloy-tuloy na daloy kasabay ng nauubos na reserba ay nangangahulugang ipinapakita ng signal ng ferricyanide ang patuloy na reduksiyon, hindi ang pag-alis ng mga molekula ng tina mula sa solusyon.

Ganap na inalis ng ikalawang kasangkapan ang hakbang ng pagtawid. Ikinabit ng grupo ang toluidine blue O, isang malapit na kauri ng thiazine, sa isang malaking kadena ng polyacrylamide na napakalaki upang makapasok sa selula sa alinmang estado ng oksidasyon. Nareduse pa rin ng mga selula ang nakakabit na tina. Samakatuwid, hindi kailangan ng reduksiyon ang pagpasok sa loob ng selula. Ang mekanismong gumagawa nito ay nakalantad sa ibabaw o nakakaugnay rito sa pamamagitan ng elektrikal na koneksiyon.

Pagkatapos ay dumating ang paghihiwalay na pinagmulan ng pamagat ng papel. Matinding pinigilan ng cyanide at azide sa 2 millimolar ang pag-iipon ng tina. Sa ilalim ng mikroskopyo, halos naglaho ang mga namuong madilim na asul at lila na karaniwang nakapalibot sa nukleo. Gayunman, hindi pinabagal ng alinman sa dalawang inhibitor ang reduksiyon sa labas ng selula: nagpatuloy nang walang paghina ang siklo ng ferricyanide at nareduse pa rin ang polimer na hindi nakatatagos. Nasa kasunod na bahagi ang pagharang. Pinipigil ng cyanide at azide ang muling oksidasyon at pagkulong sa loob ng selula, hindi ang reduksiyon sa ibabaw. Sinuportahan ng mga kontrol sa pagiging buhay ng selula ang interpretasyong ito, dahil napanatili ng mga selula ang kanilang panandang enzyme sa cytosol na lactate dehydrogenase sa buong mga paggamot na ito. Kaya ang pagkawala ng pagsipsip ay hindi basta dulot ng pagkalason o pagkapunit ng membrana.

May isang paalala mula sa papel na nananatiling mahalaga. Nasa paligid ng nukleo ngunit wala sa loob nito ang mga asul na namuong bahagi, na naaayon sa oksidasyon sa loob ng mga organelo ng selula. Gayunman, hindi tinukoy ng pag-aaral kung aling mga organelo ang mga iyon. Tinawag na lysosomal ang mga katulad na padron sa ibang uri ng selula batay sa mahihinang ebidensiya. Ituring na napatunayan ang pagkulong, ngunit pansamantala pa lamang ang pagtukoy sa lokasyon nito. Ang mga mambabasang sumusubaybay kung saan susunod na napupunta ang mga elektron ay maaaring magpatuloy sa transportasyon ng elektron at pagproseso ng redox sa mitochondria at sa mas malawak na larawan ng pagsipsip at distribusyon ayon sa ruta.

Hindi katumbas ng pagkakalantad ang paglamlam

Ipinapakita ng ikatlong pag-aaral kung ano ang nangyayari kapag iniuugnay ang mekanismong ito ng pagsipsip sa isang biyolohikal na sukatan. Natuklasan ni Scott at ng kaniyang mga kasamahan na direktang nagbubuklod sa methylene blue ang methyl beta cyclodextrin, isang asukal na hugis-singsing o torus. Ang konstante ng asosasyon nito ay humigit-kumulang 310 per molar para sa inclusion complex, kumpara sa mga 5846 per molar para sa pagbuo ng dimer ng tina. Sa mga L929 fibroblast, ang pagbubuklod na ito ay humarang kapwa sa paglamlam ng selula at sa pagpapasigla ng pagsipsip ng glucose: napigilan ng paunang inkubasyon kasama ng cyclodextrin ang asul na paglamlam, at pinabilis ng pagdaragdag nito pagkatapos ang pag-alis ng kulay. Habang nawawala sa mga selula ang optikal na asul na signal, kasabay nitong humihina ang napasiglang transportasyon ng glucose.

Itinuring ng mga may-akda ang ugnayang ito bilang mas pabor sa direktang interaksiyon ng tina at ng isang protina sa landas ng pag-aktibo ng glucose transporter kaysa sa isang matagal na mekanismo ng oxidative stress. Makatwiran ang paghihinuha na iyon, ngunit may mga hangganan. Hindi tinutukoy ng eksperimento ang protina, hindi nito ipinapakita ang pagbubuklod sa mismong transporter, at hindi maibubukod ng ugnayan sa pagitan ng pag-alis ng kulay at pagkawala ng epekto ang lahat ng landas na namamagitan ang redox.

Ang pangmatagalang aral ay tungkol sa pagsukat. Ipinapakita ng optikal na paglamlam ang nakikita, naoksida, at kaugnay-sa-selulang tina. Lubos nitong hindi nakikita ang walang-kulay na bahaging nareduse, kaya maaari pa ring may mga katumbas ng tina ang isang maputlang selula. Ang isang selulang matindi ang pagkakalamlam naman ay nagpapakita ng nakulong na naoksidang tina sa halip na kabuuang pagkakalantad ng tisyu o laki ng epekto. Ang parehong pag-iingat ay naaangkop sa mas malawak na antas: ang paghahambing ng paglamlam sa iba't ibang uri ng selula, o ang pagturing sa madilim na hiwa ng tisyu bilang patunay ng mas mataas na pagkakalantad, ay pag-uulit ng orihinal na pagkakamali sa sisidlan. Ang pagsipsip ay isang siklo ng reduksiyon, difusyon, at muling oksidasyon, at isang bahagi lamang nito ang nakikita sa anumang iisang larawan ng asul na anyo. Tuwirang nagmumula rito ang mga praktikal na implikasyon para sa paglamlam at paghawak sa laboratoryo at para sa pagbibigay-kahulugan sa mga pahayag tungkol sa dosis at pagkakalantad.