Methylene blue at leucomethylene blue: isang pares na redox, dalawang kulay

Naglagay ang isang estudyante ng ilang patak ng asul na tina sa isang prasko, pinaikot ito, at pinanood na mawala ang kulay. Inalog niya ang prasko at bumalik ang asul. Walang idinagdag o inalis sa pagitan ng dalawang kalagayan maliban sa mga elektron at pagkakalantad sa hangin. Nasa praskong iyon ang buong paksa ng artikulong ito: ang methylene blue at ang kapareha nitong sumailalim sa reduksiyon, ang leucomethylene blue, na nagpapalitan ng anyo bilang isang nababaligtad na pares na redox kung saan kulay ang ipinapakitang resulta.

Unahin natin ang praktikal na punto. Hindi pangalawang epekto lamang ang pagbabago ng kulay dito. Ito ang analitikal na senyas. Sinumang gumagawa ng pormulasyon, nagsasagawa ng titrasyon, o nagtuturo gamit ang methylene blue ay dapat kayang isulat ang kalahating reaksiyon mula sa memorya, sabihin ang mga kondisyong nagtutulak dito pakaliwa o pakanan, at tukuyin ang mga impurity na nagpapalabo sa resulta.

Ang pares sa isang ekwasyon

Ang naoksidang methylene blue ay ang kation na methylthioninium: isang patag na sistemang phenothiazinium na may sulfur at nitrogen sa gitnang singsing at isang pangkat na dimethylamino sa bawat dulo, na ibinibigay bilang asin na chloride. Nakatala ito sa PubChem bilang methylthioninium chloride, C.I. Basic Blue 9. Sa tubig, sumisipsip ang monomer ng liwanag malapit sa 664 nm, na siyang asul na nakikita ng mata.

Ang leucomethylene blue (LMB) na nabuo sa reduksiyon ay may parehong balangkas, ngunit naprotonahan ang nitrogen sa gitnang singsing at nasira ang chromophore. Wala itong karga malapit sa neutral na pH at halos walang kulay, na may napakaliit na absorbansiya sa nakikitang liwanag at malakas na banda sa ultraviolet malapit sa 258 nm (tala ng PubChem para sa leucomethylene blue, CAS 613-11-6). Nakadepende sa pH ang bilang ng proton sa kalahating reaksiyon, dahil tumatanggap ng mga proton sa asido ang anyong nabuo sa reduksiyon (tinatayang mga halagang pKa malapit sa 4.5 at 5.8). Tatlong rehimen ang sumasaklaw sa praktikal na saklaw:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, asul <=> walang kulay (malapit sa neutral na pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), asul <=> walang kulay (katamtamang asidiko, 2 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> species na leuco na may dalawang dagdag na proton (matinding asidiko, 3 proton)

Inilalarawan ng lahat ng tatlong anyong ito ang parehong pares sa magkakaibang kalagayan ng protonasyon, isang puntong sistematikong tinatalakay sa literatura tungkol sa asal na redox ng mga tinang thiazine. Ang pagdepende sa pH ay sumusunod sa ekwasyon ni Nernst para sa Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, na nagbibigay ng slope na humigit-kumulang 29.6, 59.2, o 88.7 mV bawat yunit ng pH para sa m = 1, 2, o 3. Pinatutunayan ng mga nasukat na slope na malapit sa 28, 58, at 87 mV bawat yunit ng pH ang pagtutumbas na ito, kaya walang saysay ang isang iniulat na potensiyal kung walang kasamang pH.

Ano ang sinasabi ng ekwasyon sa gumagawa ng pormulasyon

Tatlong katotohanan ang sumusunod mula sa estokiyometriya. Una, dahil dalawang elektron ang kasangkot sa bawat molekula, ang methylene blue ay isang tagapagpahiwatig at tagapamagitan na gumagamit ng dalawang elektron, hindi tagapaglipat ng isang elektron, sa kabuuang reaksiyon nito. Ikalawa, nakikilahok ang mga proton, kaya nagbabago ang pormal na potensiyal kasabay ng pH gaya ng inilarawan sa itaas. Ikatlo, ang pormal na potensiyal sa pH 7 ay malapit sa +0.011 V kumpara sa pamantayang elektrodong hydrogen (humigit-kumulang +0.53 V sa pH 0), na naglalagay sa pares sa hanay ng mga banayad na ahenteng pang-oksida: sapat ang lakas para kumuha ng mga elektron mula sa mahuhusay na donor gaya ng NAD(P)H o ascorbate, ngunit sapat ang kahinaan para ipasa ang mga ito sa natunaw na oxygen o sa mga sentrong ferric. Ang puwestong iyon sa gitna ang mismong dahilan kung bakit paulit-ulit na nagpapalitan ng anyo ang tina sa halip na manatili sa isang dulo.

May dagdag na komplikasyong dulot ang konsentrasyon. Sa higit sa humigit-kumulang isang daang micromolar sa tubig, na naaayon sa iniulat na konstante ng disosasyon ng monomer at dimer na malapit sa 170 hanggang 250 uM sa pH 7, nagsasalansan ang naoksidang kation upang bumuo ng mga dimer at mas malalaking agregatong may bandang absorpsiyon na lumipat sa malapit sa 610 hanggang 615 nm. Kaya ang spektrong tila wala sa inaasahang tuktok ay maaaring magpahiwatig ng agregasyon, hindi impurity. Palabnawin muna bago suriin.

Mga kondisyong nagtutulak sa bawat direksiyon

Ang talahanayan sa ibaba ay sanggunian para sa gawain sa laboratoryo. Nangangailangan ang reduksiyon ng donor ng elektron; nangangailangan ang muling oksidasyon ng tagatanggap ng elektron, at karaniwang sapat na ang hangin.

Sumusunod ang bawat hanay sa parehong ekwasyon. Tanging puwersang nagtutulak ang nagbabago. Ito ang ibig sabihin ng pagiging nababaligtad ng pares: iisa ang landas, na tinatahak sa magkasalungat na direksiyon sa ilalim ng magkasalungat na kondisyon.

Paliwanag sa asul na bote

Dapat ipaliwanag nang malinaw ang mekanismo ng demonstrasyong ito dahil ipinapakita nito ang pares sa maliit na sukat. Sa alkalinong solusyon ng glucose, itinataguyod ng base ang enolisasyon ng glucose at ang nabubuong enediolate ang nagrereduce sa methylene blue upang maging leucomethylene blue, kaya nawawalan ng kulay ang laman ng prasko. Tinutunaw ng pag-alog ang oxygen mula sa espasyong nasa ibabaw ng likido, muling inooxidize ng oxygen ang anyong leuco, at bumabalik ang asul. Kapag pinabayaang nakatigil, nauubos ang natunaw na oxygen malapit sa sona ng reaksiyon sa ibabaw at muling nangingibabaw ang glucose. Nauulit ang siklo hanggang maubos ang glucose, at bawat pag-alog ay isang nakikitang ekwasyon ni Nernst: pataasin ang aktibidad ng ahenteng pang-oksida at lilipat ang ekilibriyo tungo sa asul.

Ang radikal sa gitna

Dalawang elektron ang inililipat sa kabuuang reaksiyon, ngunit paisa-isa ang paglipat sa mga elementar na hakbang. Sa pagitan ng asul na kation at walang-kulay na anyong leuco ay may intermedyang radikal na semiquinone na karaniwang sumasailalim sa disproporcionasyon upang muling mabuo ang pares sa halip na maipon. Ang potensiyal nito para sa isang elektron na malapit sa negatibong 0.23 V sa pH 7 ay malayong mas mababa kaysa sa gitnang potensiyal ng kabuuang reaksiyon na may dalawang elektron, kaya nananatiling maliit na bahagi ang radikal sa matatag na kalagayan. Mahalaga ito sa dalawang dahilan. Kapag naiilawan, naaabot ng tina ang mga estadong mas mataas ang enerhiya na nagbubukas ng mga landas na kinasasangkutan ng radikal, kaya sensitibo sa liwanag ang mga solusyon ng methylene blue at dapat isama ang photochemistry sa anumang protokol ng katatagan. At sa mataas na konsentrasyon, bumubuo ng dimer ang naoksidang anyo, na nagpapabago sa spektrum at sa nakikitang kinetika nang hindi binabago ang mismong pares. Hindi sinisira ng alinman sa dalawang katotohanang ito ang pagiging nababaligtad. Pareho nilang ipinapaliwanag ang mga obserbasyong kung hindi ay magmumukhang hindi nababaligtad.

Binabago ng mga kaanak na inalisan ng methyl ang sukatan

Alisin ang mga pangkat na methyl mula sa dalawang sangay na dimethylamino at mananatili ang pares, ngunit magbabago ang mga katangian nito. Tuluy-tuloy na lumilipat ang pinakamataas na absorpsiyon tungo sa asul sa bawat pag-alis ng methyl: methylene blue malapit sa 664 nm, Azure B malapit sa 654, Azure A malapit sa 630, Azure C malapit sa 615, at thionine malapit sa 600 nm. Ang Azure B, na kulang ng isang pangkat na methyl, ang pinakamalapit na kaanak: isang pangunahing metabolite ng methylene blue at isang dokumentadong impurity sa materyal na methylene blue. Ipinagpapatuloy ng Azure A at Azure C ang serye na may parehong balangkas na aktibo sa redox. Ang thionine, na ganap na inalisan ng methyl ang parehong pangkat na amino, ay nasa dulo na may pormal na potensiyal na malapit sa +0.06 V sa pH 7 kumpara sa methylene blue na nasa +0.011 V, kaya kapansin-pansing mas madali itong sumailalim sa reduksiyon. Nakadepende sa medium at elektrod ang mga potensiyal na redox sa buong serye, kaya ihambing lamang ang mga halaga sa loob ng iisang hanay ng mga kondisyon. Ito ang dahilan kung bakit usaping redox ang pagtukoy sa mga impurity, hindi simpleng paglalagay lamang ng tsek sa kadalisayan. Ang ilang porsiyento ng Azure B ay nangangahulugan ng ilang porsiyento ng ibang pares na redox sa bote, at idinodokumento ng Azure B bilang impurity at metabolite kung paano kinokontrol ang bahaging iyon.

Kung saan pumapasok ang biyolohiya

Sa loob ng isang pulang selula ng dugo, nirereduce ng NADPH ang methylene blue upang maging leucomethylene blue, at ipinapasa ng anyong leuco ang mga elektron sa ferric na iron ng heme, na nagpapanumbalik sa ferrous na kalagayan ng hemoglobin. Ang nag-iisang pagpapasang iyon ng elektron ang kemikal na batayan ng paggamit ng methylene blue sa acquired methemoglobinemia. Lahat ng sumusunod sa pagpapasang iyon—metabolismo ng enerhiya, daloy ng elektron sa mitochondria, at anumang biyolohikal na kinalabasan—ay kabilang sa transportasyon ng elektron sa mitochondria at sadyang iniiwan sa paksang iyon.

Bilhin ang pares, hindi lang ang kulay

Nakabatay sa espesipikasyon ang kalidad ng isang tinang redox. Mahalaga ang mataas na kadalisayan dahil ang methylene blue na hindi sumusunod sa USP ay karaniwang pang-tela, na may dalang Azure B, mabibigat na metal, o natitirang solvent na nagbabago sa mga sukat ng redox at nagpapalabo sa mga puntong pagtatapos ng titrasyon—mga bagay na hindi sinusuri ng anumang protokol sa paglamlam. Karamihan sa mga nagbebentang nagsasabing sumusunod sila sa USP ay mabibigat na metal lamang ang sinusuri at itinuturing na sapat na iyon. Saklaw ng buong pagsunod ang pagkakakilanlan, pagsusukat ng nilalaman, mga organikong impurity, natitirang solvent, mga impurity na elemento, nalalabi pagkatapos ng pagsunog, mga limitasyong mikrobiyal, at mga endotoxin ng bakterya, at ginagabayan ng kung paano pumili ng methylene blue na antas-parmasyutiko ang pagbasa sa dokumentasyong iyon. Nakikipagtulungan ang Blupreme sa isang tagagawang parmasyutiko ng methylene blue, sinusuri ang buong espesipikasyon ng USP, at inilalathala ang kumpletong COA. Kapag kulay ang sinusukat, bahagi ng instrumento ang dokumentasyong iyon.