ทางเลือกแทน methylene blue สำหรับกล้องจุลทรรศน์: เลือกตามงาน

สำหรับสเมียร์แบคทีเรียแบบง่าย crystal violet สามารถใช้แทน methylene blue ได้เมื่อเป้าหมายคือการดูรูปร่างของเซลล์ สำหรับเซลล์ที่มีชีวิต ทางเลือกที่เหมาะกว่าอาจเป็น phase contrast โดยไม่ใช้สีย้อมเลย การเลือกขึ้นอยู่กับสิ่งที่คุณต้องการสังเกต

สมมติว่าคนสองคนกำลังตรวจดูเชื้อแบคทีเรียเพาะเลี้ยงชุดเดียวกัน คนหนึ่งต้องการแยกเซลล์รูปแท่งออกจากเซลล์ทรงกลม อีกคนต้องการทราบว่าการจัดการบางอย่างทำให้แบคทีเรียตายหรือไม่ สีย้อมที่ให้ภาพชัดเจนสำหรับคนแรกอาจไม่ให้คำตอบที่ใช้ได้สำหรับคนที่สอง

ก่อนเลือกสารทดแทน ให้เติมประโยคนี้ให้สมบูรณ์: “ฉันต้องการสังเกต ___ ใน ___ และเซลล์ต้อง / ไม่จำเป็นต้องมีชีวิตอยู่” ประโยคนี้เป็นตัวกำหนดว่าสีย้อมต้องทำหน้าที่อะไร

เริ่มจากตัวอย่างและคำถาม

ก่อนอื่นให้ตัดสินใจว่าเซลล์จำเป็นต้องมีชีวิตอยู่หรือไม่ จากนั้นระบุลักษณะที่คุณต้องการสังเกต:

• เซลล์ต้องมีชีวิตอยู่: สำหรับการเคลื่อนไหวหรือรูปร่าง ให้พิจารณา phase contrast หรือ DIC โดยไม่ย้อมสี; สำหรับ DNA ในนิวเคลียส ให้พิจารณา Hoechst 33342 ร่วมกับ fluorescence; สำหรับความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ ให้เลือกวิธีทดสอบที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้ เช่น SYTO 9 ร่วมกับ propidium iodide
• เซลล์ไม่จำเป็นต้องมีชีวิตอยู่: สำหรับสัณฐานวิทยาของแบคทีเรีย ให้พิจารณาการย้อมแบบง่ายด้วย crystal violet หรือการย้อมแบบ negative stain ด้วย nigrosin; สำหรับปฏิกิริยา Gram ให้ใช้วิธี Gram-stain แบบครบขั้นตอน; สำหรับ DNA ในนิวเคลียสของเซลล์ที่ตรึงแล้ว ให้พิจารณา DAPI fluorescence

ใช้ตารางนี้เพื่อเปรียบเทียบข้อจำกัดของแต่ละทางเลือก สิ่งเหล่านี้เป็นการเลือกวิธี ไม่ใช่คำแนะนำให้เปลี่ยนขวดสารภายในโปรโตคอลที่มีอยู่แล้ว

สำหรับสเมียร์แบบง่าย ให้เปลี่ยนวิธีอย่างระมัดระวัง

Crystal violet เป็นตัวเลือกที่ใช้งานได้จริงเมื่อเป้าหมายคือการดูสัณฐานวิทยาของแบคทีเรียด้วยสีเดียว Bacteriological Analytical Manual ของ FDA ระบุ สูตร crystal violet สองสูตรที่เหมาะสำหรับการย้อมแบบง่าย ใช้สูตรที่มีเอกสารกำกับและวิธีเตรียมตามที่ระบุไว้; ชื่อของสีย้อมเพียงอย่างเดียวไม่ได้ระบุรีเอเจนต์พร้อมใช้งานที่แน่นอน

Crystal violet ยังใช้ในการย้อม Gram แต่ไม่ได้หมายความว่าการย้อมแบบง่ายด้วย crystal violet จะเป็น Gram stain ใน โปรโตคอล Gram-stain ของ ASM ผลการแยกความแตกต่างขึ้นอยู่กับ crystal violet, iodine, การล้างสี และ counterstaining ที่ทำงานตามลำดับ การตัดขั้นตอนเหล่านี้ออกจะเปลี่ยนสิ่งที่สามารถสรุปจากภาพได้ ดู การย้อมแบบง่ายเทียบกับการย้อม Gram สำหรับความแตกต่างนี้

Nigrosin เป็นอีกวิธีหนึ่งในการทำให้เห็นขอบเขตของเซลล์ โดยทำให้พื้นหลังมืดลง ขณะที่เซลล์แบคทีเรียยังคงสว่างกว่าโดยเปรียบเทียบ มีรายละเอียดสำคัญใน คำแนะนำการใช้ nigrosin ของ Merck ซึ่งรายการสารทดแทนทั่วไปอาจมองข้าม สูตรพร้อมใช้งานที่ระบุไว้มี formaldehyde อยู่ด้วย ดังนั้นจึงไม่สามารถอนุมานความเข้ากันได้กับเซลล์มีชีวิตจากคำว่า “negative stain” เพียงอย่างเดียว แม้ตัวเซลล์จะดูเหมือนไม่ติดสีก็ตาม ให้ตรวจสอบสูตรทั้งหมดและวิธีเตรียมตัวอย่าง

สำหรับตัวอย่างที่มีชีวิต ให้พิจารณาเปลี่ยนออปติก

หากคุณต้องการสังเกตเซลล์เคลื่อนไหวหรือแบ่งตัว การเติมสีย้อมอีกชนิดอาจทำให้การสังเกตซับซ้อนขึ้น ตามที่ Nikon อธิบายในคู่มือเรื่อง contrast ในตัวอย่างโปร่งใส phase contrast และ differential interference contrast หรือ DIC ทำให้มองเห็นตัวอย่างได้จากความแตกต่างของสมบัติทางแสง วิธีเหล่านี้สามารถแสดงเซลล์มีชีวิตที่ไม่ย้อมสีได้ หากกล้องจุลทรรศน์มีส่วนประกอบที่จำเป็น

ทางเลือกนี้ช่วยคงตัวอย่างไว้โดยไม่ย้อมสี แต่ข้อมูลที่ได้จะเปลี่ยนไป คุณสามารถติดตามขอบเขตหรือการเคลื่อนไหวได้โดยไม่ทราบว่าโมเลกุลใดเป็นต้นกำเนิดของ contrast หากคำถามคือการระบุตำแหน่งของโมเลกุล ให้เลือกวิธีติดฉลากที่เหมาะสมแทน

สำหรับ DNA ในนิวเคลียส การเปรียบเทียบ DAPI และ Hoechst stains ของ Invitrogen แยกการใช้งานทั่วไปของ DAPI กับเซลล์ที่ตรึงแล้วออกจาก Hoechst 33342 ซึ่งผ่านเข้าสู่เซลล์ได้มากกว่าและนิยมใช้สำหรับติดฉลากเซลล์มีชีวิต ทั้งสองชนิดต้องใช้อุปกรณ์ fluorescence และไม่มีชนิดใดเป็นสารทดแทนโดยตรงสำหรับสีย้อมสีใน brightfield

ให้ถือว่าการสัมผัสสีย้อมและการให้แสงเป็นเงื่อนไขของการทดลอง เปรียบเทียบตัวอย่างที่ย้อมสีกับตัวอย่างที่ไม่ย้อมสีเมื่อพฤติกรรมของเซลล์เป็นสิ่งที่คุณกำลังวัด

เซลล์สีแดงไม่ได้หมายความว่าเป็นเซลล์ตายโดยอัตโนมัติ

SYTO 9 และ propidium iodide มักใช้ร่วมกันเพื่อประเมินความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มแบคทีเรีย คู่มือ BacLight เชื่อมโยงเยื่อหุ้มที่สมบูรณ์กับการย้อมสีเขียว และเยื่อหุ้มที่เสียหายกับการย้อมสีแดง การตีความนี้ต้องผ่านการตรวจสอบความใช้ได้สำหรับตัวอย่างนั้น

การศึกษาในปี 2019 โดย Rosenberg และคณะ แสดงให้เห็นปัญหานี้ ในไบโอฟิล์ม E. coli อายุ 24 ชั่วโมงบนกระจกใน phosphate-buffered saline เซลล์ประมาณ 96% ดูเหมือนให้ผลบวกต่อ propidium iodide เมื่อสังเกตในตำแหน่งเดิม อย่างไรก็ตาม ผู้วิจัยประเมินว่า 82% ยังสามารถเพาะเลี้ยงได้หลังการเก็บตัวอย่าง ภาพ confocal แสดงเซลล์ที่มีภายในเป็นสีเขียวอยู่ใต้สารที่ติดสีแดง ซึ่งบ่งชี้ว่ากรดนิวคลีอิกนอกเซลล์มีส่วนทำให้เกิดสัญญาณที่ชวนให้ตีความผิด

เปอร์เซ็นต์เหล่านี้เป็นผลจากการวัดคนละประเภทในตัวอย่างของงานวิจัยนั้น ไม่ใช่ค่าปรับแก้ที่ใช้ได้ทั่วไป ประเด็นสำคัญคือควรตรวจสอบว่าอะไรเป็นแหล่งกำเนิดสัญญาณ ในไบโอฟิล์ม สีย้อมกรดนิวคลีอิกสามารถตรวจพบสารที่อยู่นอกเซลล์ได้ เช่นเดียวกับสารภายในเซลล์ที่เสียหาย สำหรับการสรุปเรื่องการมีชีวิต ผู้วิจัยแนะนำให้ใช้การวัดเสริม เช่น การเพาะเลี้ยงหรือกิจกรรมเมแทบอลิซึม พร้อมยอมรับว่าแต่ละวิธีก็มีข้อจำกัด

ตรวจสอบว่าทางเลือกนั้นมีส่วนประกอบอะไรจริง

วิธีย้อมสีทางเลือกอาจยังมี methylene blue อยู่ Giemsa เป็นตัวอย่างหนึ่ง โดย Merck อธิบายผลิตภัณฑ์ของตนว่าเป็น สารละลาย azure-eosin-methylene-blue สำหรับการใช้งานที่รวมถึงสเมียร์เลือดและไขกระดูก วิธีนี้อาจเป็นอีกวิธีหนึ่งสำหรับตัวอย่างอีกประเภทหนึ่ง แต่ไม่ตรงตามข้อกำหนดที่ต้องไม่มี methylene blue

หากการไม่ใช้สารประกอบชนิดหนึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการทดลอง ให้ตรวจสอบเอกลักษณ์และสูตรของรีเอเจนต์ก่อนเปรียบเทียบภาพ คู่มือเรื่อง methyl blue, methylene blue และสีย้อมที่มีชื่อคล้ายกัน อธิบายความแตกต่างด้านการตั้งชื่อ

ตรวจสอบการทดแทนก่อนนำผลไปใช้

สำหรับวิธีใหม่ ให้ทำการเปรียบเทียบขนาดเล็กโดยใช้ตัวอย่างที่เป็นตัวแทนและตัวควบคุมที่เหมาะสม รักษาการตั้งค่ากล้องจุลทรรศน์ให้เปรียบเทียบกันได้เมื่อเป็นไปได้ บันทึกสูตรรีเอเจนต์ วิธีเตรียมตัวอย่าง การสัมผัส และเงื่อนไขการถ่ายภาพ เพื่อให้สามารถตรวจสอบสาเหตุของภาพที่ดูดีกว่าได้ แทนที่จะเลือกเพียงเพราะภาพดูดีกว่า

ประเมินความสำเร็จตามคำถามเดิม สำหรับสัณฐานวิทยา ให้ประเมินว่ายังสามารถตีความขอบเขตและการจัดเรียงของเซลล์ได้หรือไม่ สำหรับการติดฉลากนิวเคลียส ให้ประเมินตำแหน่งของสัญญาณและพื้นหลัง สำหรับการมีชีวิต ให้ต้องการหลักฐานมากกว่าการแยกสีที่ดูชัดเจน คู่มือฉบับกว้างกว่าเรื่อง การย้อม methylene blue และการประยุกต์ใช้ในห้องปฏิบัติการ อธิบายว่าการสังเกตและการเตรียมตัวอย่างเชื่อมโยงกันอย่างไร

เลือกทางเลือกที่รักษาการวัดที่คุณต้องการไว้ สีเป็นเพียงคุณสมบัติหนึ่งของภาพที่ได้