การละลายของเมทิลีนบลูและการเตรียมสารละลาย: คู่มือสำหรับห้องปฏิบัติการ

เจ้าหน้าที่เทคนิคสองคนต่างเตรียมสารละลายเมทิลีนบลู 1 เปอร์เซ็นต์จากผง คนหนึ่งชั่ง 1.00 กรัม แล้วปรับปริมาตรในขวดให้เป็น 100 mL อีกคนชั่ง 1.00 กรัม เติมลงในน้ำ 100 mL แล้วถือว่าเสร็จ เจ้าหน้าที่เทคนิคคนที่สามชั่ง 1.00 กรัมจากอีกล็อตหนึ่ง แล้วได้ความเข้มข้นต่างออกไปจนวัดได้ ขวดทั้งสามติดฉลากเหมือนกัน ไม่มีขวดใดมีสารละลายตรงตามที่ฉลากระบุเสียทีเดียว และความแตกต่างนี้มาจากแนวคิดสามเรื่องที่สับสนกันได้ง่าย ได้แก่ ตัวทำละลายรองรับสารได้มากเพียงใด ผงที่ชั่งนั้นแท้จริงคืออะไร และเปอร์เซ็นต์นั้นอ้างอิงถึงอะไร

คู่มือนี้กล่าวถึงการเตรียมสารสำหรับห้องปฏิบัติการเท่านั้น ได้แก่ สารย้อมสี อินดิเคเตอร์ สารละลายตั้งต้นสำหรับงานวิเคราะห์ และสารละลายเจือจางสำหรับใช้งาน ไม่ใช่สูตรเตรียมยาสำหรับรับประทานหรือฉีด และไม่ควรตีความความเข้มข้นในที่นี้ว่าเป็นขนาดยา

ค่าการละลายกำหนดอะไร และไม่ได้กำหนดอะไร

เมทิลีนบลูมีค่าการละลายในน้ำสูงเมื่อเทียบกับสีย้อม ข้อมูลสารประกอบเมทิลีนบลูใน PubChem รายงานค่าประมาณ 43.6 กรัมต่อลิตรที่ 25 C ซึ่งเท่ากับ 4.36 กรัมต่อ 100 mL หรือ 4.36 เปอร์เซ็นต์ w/v การศึกษาสมดุลการละลายโดยอิสระที่อุณหภูมิเดียวกันวัดได้ 43.21 g/L และยืนยันว่าค่าก่อนหน้านี้สอดคล้องกันภายในขอบเขตความคลาดเคลื่อนของการทดลอง

ตัวเลขนี้เป็นเพดาน ไม่ใช่เป้าหมาย สารละลายตั้งต้น 1 เปอร์เซ็นต์มีความเข้มข้น 10 g/L ซึ่งต่ำกว่าหนึ่งในสี่ของเพดาน ส่วนสารละลายตั้งต้น 0.1 เปอร์เซ็นต์มีความเข้มข้น 1 g/L หรือประมาณหนึ่งในสี่สิบของเพดาน หากการเตรียมสารละลาย 1 เปอร์เซ็นต์ยังมีของแข็งหลงเหลืออยู่หลังผสมอย่างเหมาะสมที่อุณหภูมิห้อง ปัญหาแทบไม่เคยเกิดจากขีดจำกัดการละลาย โดยทั่วไปมักเกิดจากผงเปียกไม่ทั่วถึง น้ำเย็น ผงจับเป็นก้อนซึ่งต้องใช้เวลาละลายเพิ่ม หรือระบุชนิดตัวถูกละลายผิด น้ำอุ่นและการคนแก้ปัญหาเหล่านี้ได้ส่วนใหญ่ หากใช้ความร้อน ให้รอจนขวดกลับสู่อุณหภูมิที่ใช้สอบเทียบก่อนปรับให้ได้ปริมาตรสุดท้าย

ค่าการละลายในตัวทำละลายอื่นต่ำกว่าและมีความสอดคล้องกันระหว่างแหล่งข้อมูลน้อยกว่า ส่วนหนึ่งเพราะสารที่ทดสอบมีสถานะไฮเดรตต่างกัน น้ำยังคงเป็นตัวทำละลายอ้างอิงสำหรับสารละลายตั้งต้นที่ใช้เป็นประจำในห้องปฏิบัติการ เอทานอลละลายสีย้อมนี้ได้ แต่รองรับปริมาณได้น้อยกว่าน้ำมาก คลอโรฟอร์มก็ละลายได้เช่นกัน ไพริดีนละลายได้เพียงเล็กน้อย และไดเอทิลอีเทอร์แทบไม่ละลายเลย ในชุดข้อมูลการวัด อะซีโตนและเอทิลอะซีเตตมีค่าต่ำกว่าน้ำมาก สำหรับงานที่ไม่ใช้น้ำเป็นตัวทำละลาย ให้ถือว่าตัวเลขในคู่มือเป็นค่าประมาณเบื้องต้นและตรวจสอบกับสารล็อตที่ใช้จริง แทนที่จะถือเป็นขีดจำกัดในการเตรียมสาร ประเด็นในทางปฏิบัตินั้นเรียบง่าย: หากเป้าหมายคือความเข้มข้นในสารละลายน้ำที่ระบุชัดเจนและไม่เกิน 1 เปอร์เซ็นต์ น้ำมีขีดความสามารถในการละลายเหลืออยู่อีกมาก

ผงไม่ได้มีเพียงรูปแบบเดียว

ผงเมทิลีนบลูที่จำหน่ายสำหรับใช้ในห้องปฏิบัติการเป็นเกลือคลอไรด์ที่มีน้ำอยู่ในโครงผลึก และปริมาณน้ำนั้นแปรผันได้ ไอออนในรูปไร้น้ำมีน้ำหนักโมเลกุล 319.85 g/mol รูปไตรไฮเดรตที่มักอ้างถึงมีค่า 373.90 g/mol และรูปเพนตะไฮเดรตมีค่า 409.93 g/mol ซึ่งเป็นค่าที่แสดงไว้ใน ข้อมูลโมโนกราฟ USP ที่สรุปไว้ประกอบข้อมูลใน PubChem

ขวดที่จำหน่ายเชิงพาณิชย์มักติดฉลากว่าไตรไฮเดรต หมายเลข CAS 7220-79-3 แต่การศึกษาสถานะของแข็งพบว่าสารจริงอาจเป็นเพนตะไฮเดรต ไฮเดรตบางส่วนที่มีน้ำประมาณ 2.2 โมเลกุล ไดไฮเดรต หรือโมโนไฮเดรต โดยการวิเคราะห์บางงานไม่พบเฟสผลึกไตรไฮเดรตที่แยกชัดเจน สีย้อมนี้ยังดูดความชื้นได้ด้วย จึงทำให้ปริมาณน้ำในขวดที่เปิดแล้วเปลี่ยนไป สำหรับการย้อมสีเชิงคุณภาพ เรื่องนี้แทบไม่มีผล แต่สำหรับงานวิเคราะห์เชิงปริมาณมีผลอย่างมาก ด้วยเหตุนี้ คำแนะนำในการอ่านค่าปริมาณสารและปริมาณน้ำในใบรับรองผลการวิเคราะห์ จึงให้ยึดเอกสารประจำล็อตเป็นหลักเหนือคำว่าไตรไฮเดรตบนฉลากด้านหน้า

จากเรื่องนี้มีแนวทางปรับแก้สองแบบ และควรใช้เพียงแบบเดียวในแต่ละครั้ง หากใบรับรองระบุค่าปริมาณสารและปริมาณน้ำหรือค่าการสูญเสียน้ำหนักเมื่อทำให้แห้ง ให้ใช้ตัวเลขเหล่านั้นโดยตรง หากไม่มีข้อมูลจากใบรับรองและต้องแสดงความเข้มข้นบนฐานสมมูลไร้น้ำ ให้ใช้ตัวคูณไฮเดรตตามทฤษฎี ได้แก่ 373.90 หารด้วย 319.85 หรือ 1.169 สำหรับสารที่ระบุว่าเป็นไตรไฮเดรต และ 409.93 หารด้วย 319.85 หรือ 1.282 สำหรับสารที่ระบุว่าเป็นเพนตะไฮเดรต อย่าใช้การปรับแก้ทั้งสองแบบพร้อมกัน เพราะจะเป็นการนับน้ำซ้ำ

เปอร์เซ็นต์หมายถึงอะไร

เปอร์เซ็นต์ w/v หมายถึงจำนวนกรัมของตัวถูกละลายที่ระบุ ต่อสารละลายปริมาตรสุดท้าย 100 mL ไม่ใช่ต่อน้ำตั้งต้น 100 mL ดังนั้น 1 เปอร์เซ็นต์ w/v คือ 1.000 g ต่อปริมาตรสุดท้าย 100 mL เท่ากับ 10 mg/mL หรือ 10 g/L สารละลาย 0.1 เปอร์เซ็นต์คือ 0.100 g ต่อปริมาตรสุดท้าย 100 mL เท่ากับ 1 mg/mL การสับสนที่พบบ่อยว่า 1 เปอร์เซ็นต์เท่ากับ 1 mg/mL เป็นความคลาดเคลื่อนสิบเท่า จึงควรตรวจสอบฉลากทุกใบในประเด็นนี้

อีกส่วนหนึ่งของนิยามคือการระบุชนิดตัวถูกละลาย สารละลาย 1 เปอร์เซ็นต์ของผงไตรไฮเดรตตามมวลที่ชั่ง และสารละลาย 1 เปอร์เซ็นต์ที่แสดงบนฐานสมมูลไร้น้ำ เป็นสารละลายคนละแบบ ตัวอย่างการคำนวณด้านล่างระบุทั้งปริมาตรสุดท้ายและฐานที่ใช้อ้างอิงทุกครั้ง ซึ่งเป็นนิสัยที่ช่วยป้องกันปัญหาของเจ้าหน้าที่เทคนิคทั้งสามคนที่กล่าวถึงข้างต้น

ตัวอย่างการเตรียมพร้อมการคำนวณและข้อสมมติเรื่องไฮเดรต

ตัวอย่างทั้งหมดสมมติว่าใช้ผงบริสุทธิ์ในรูปไฮเดรตที่ระบุ และใช้น้ำเป็นตัวทำละลายที่อุณหภูมิห้อง สำหรับปริมาตรอื่นให้ปรับตามสัดส่วนเชิงเส้น

ตัวอย่าง A: 100.0 mL ที่ 1 เปอร์เซ็นต์ w/v บนฐานไตรไฮเดรตตามมวลที่ชั่ง ชั่งเมทิลีนบลูไตรไฮเดรต 1.000 g เติมน้ำบริสุทธิ์ประมาณ 70 mL คนหรือแกว่งวนจนละลายหมด ถ่ายโอนลงขวดวัดปริมาตร 100.0 mL อย่างครบถ้วนโดยล้างภาชนะเดิมและรวมของเหลวที่ล้างด้วย จากนั้นเติมน้ำจนถึงขีด ตัวถูกละลายคือไตรไฮเดรตเอง จึงไม่ต้องปรับแก้ด้วยน้ำหนักโมเลกุล ผลลัพธ์: 1.000 g ต่อปริมาตรสุดท้าย 100.0 mL หรือ 10 mg/mL ของผงตามมวลที่ชั่ง

ตัวอย่าง B: 100.0 mL ที่ 1 mg/mL บนฐานสมมูลไร้น้ำ จากสารที่ระบุว่าเป็นไตรไฮเดรต เป้าหมายคือเมทิลีนบลูไร้น้ำ 100.0 mg ในปริมาตรสุดท้าย 100.0 mL คูณด้วย 1.169 เพื่อปรับแก้สำหรับน้ำสามโมเลกุล: 100.0 mg คูณ 1.169 เท่ากับ 116.9 mg ชั่งสารที่ระบุว่าเป็นไตรไฮเดรต 116.9 mg ละลายในน้ำประมาณ 70 mL แล้วปรับให้ได้ปริมาตรสุดท้าย 100.0 mL ในขวดวัดปริมาตร หากใช้สารที่ระบุว่าเป็นเพนตะไฮเดรต ตัวคูณคือ 1.282 ดังนั้นเป้าหมายเดียวกันต้องใช้ 128.2 mg บันทึกบนฉลากว่าใช้ตัวคูณใด

ตัวอย่าง C: การเจือจางเมทิลีนบลูจากสารละลายตั้งต้น 1 เปอร์เซ็นต์เป็น 0.1 เปอร์เซ็นต์ ใช้ C1V1 เท่ากับ C2V2 หากต้องการเตรียม 0.1 เปอร์เซ็นต์ ปริมาตร 100.0 mL จากสารละลายตั้งต้น 1.0 เปอร์เซ็นต์ ปริมาตรสารละลายตั้งต้นที่ต้องใช้คือ 0.1 คูณ 100.0 หารด้วย 1.0 ซึ่งเท่ากับ 10.0 mL ใช้ปิเปตถ่ายสารละลายตั้งต้น 1 เปอร์เซ็นต์ปริมาตร 10.0 mL ลงในขวด 100.0 mL แล้วเติมน้ำจนถึงขีด สำหรับนักวิเคราะห์ที่ถนัดหน่วยมวล: 1 เปอร์เซ็นต์คือ 10 mg/mL ดังนั้น 10.0 mL มีสาร 100 mg และสาร 100 mg ในปริมาตรสุดท้าย 100.0 mL เท่ากับ 1 mg/mL ซึ่งคือ 0.1 เปอร์เซ็นต์

ตัวอย่าง D: สารละลายสำหรับใช้งาน 10 mg/L ปริมาตร 1.000 L จากสารละลายตั้งต้น 1 mg/mL สารละลายตั้งต้น 1 mg/mL เท่ากับ 1000 mg/L ปริมาตรที่ต้องใช้คือ 10 คูณ 1.000 หารด้วย 1000 ซึ่งเท่ากับ 0.0100 L หรือ 10.0 mL ใช้ปิเปตถ่ายสารละลายตั้งต้น 10.0 mL แล้วเจือจางด้วยน้ำให้ได้ปริมาตรสุดท้าย 1.000 L หากใช้สารละลายตั้งต้น 1 เปอร์เซ็นต์ที่ 10,000 mg/L เป้าหมายเดียวกันต้องใช้เพียง 1.00 mL แล้วปรับให้ได้ 1.000 L การเจือจางต่อเนื่องสองขั้นให้ความแม่นยำดีกว่าการถ่ายปริมาตรระดับไมโครลิตรเพียงครั้งเดียวเมื่ออัตราส่วนเกินประมาณหนึ่งร้อย

แต่ละตัวอย่างระบุรายละเอียดได้ครบถ้วนเพราะมีข้อมูลสามอย่าง ได้แก่ มวลที่ชั่งพร้อมข้อสมมติเรื่องไฮเดรต ปริมาตรสุดท้ายของสารละลาย และฐานอ้างอิงของความเข้มข้นที่ระบุ หากบันทึกในสมุดขาดข้อมูลใดข้อมูลหนึ่งในสามอย่างนี้ จะไม่สามารถทำซ้ำได้อย่างตรงกันทุกประการ

ขั้นตอนที่หลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดทั่วไป

เริ่มจากละลายผงในน้ำที่มีปริมาตรน้อยกว่าปริมาตรสุดท้าย แล้วจึงปรับปริมาตร การเติมผงลงในน้ำที่มีปริมาตรเท่ากับปริมาตรสุดท้ายโดยตรงจะทำให้ปริมาตรรวมของสารละลายเกินขีดที่ตั้งใจไว้ และความเข้มข้นต่ำกว่าที่ต้องการ ล้างบีกเกอร์แล้วถ่ายของเหลวที่ล้างลงในขวดเพื่อไม่ให้มีสีตกค้าง สีที่เข้มทำให้เห็นการสูญเสียแม้เพียงเล็กน้อย ซึ่งเป็นข้อดีหากช่วยให้ถ่ายโอนสารได้อย่างครบถ้วน

ผสมจนไม่มีอนุภาคเหลืออยู่ก่อนปรับปริมาตร และตรวจดูโดยส่องกับแสง กรองเฉพาะเมื่อวิธีกำหนดให้กรองเท่านั้น เมทิลีนบลูถูกดูดซับบนวัสดุเมมเบรนบางชนิดได้ ดังนั้นการกรองอาจลดความเข้มข้นของสารละลายตั้งต้นที่เพิ่งตรวจสอบความเข้มข้นตามมาตรฐาน ประเด็นนี้มีบันทึกไว้ในการศึกษาการดูดซับบนเมมเบรน และควรระลึกถึงทุกครั้งที่การกรองหรือการตรวจยืนยันความเข้มข้นเป็นส่วนหนึ่งของวิธี หากสารละลายตั้งต้นที่ผ่านการกรองต้องมีความเข้มข้นที่รับรองไว้ ให้ตรวจยืนยันความเข้มข้นหลังกรองแทนที่จะตรวจเฉพาะก่อนกรอง

เก็บสารละลายที่เตรียมแล้วให้พ้นจากแสงจ้า ในขวดสีชาหรือขวดทึบแสงที่อุณหภูมิห้อง และติดฉลากระบุตัวถูกละลาย ฐานไฮเดรต ความเข้มข้น ตัวทำละลาย วันที่ และผู้เตรียม การซีดจางจากแสงเมื่อได้รับแสงต่อเนื่องเป็นเส้นทางการเสื่อมสภาพที่ทราบกัน จึงไม่ควรเก็บไว้ริมหน้าต่างหรือในตู้เย็นที่มีแสงสว่าง แม้สีย้อมจะดูคงสภาพก็ตาม ความคงตัวที่คาดหวังและช่วงเวลาตรวจซ้ำควรพิจารณาตาม คำแนะนำด้านการเก็บรักษาและความคงตัวของสารละลายที่เตรียมแล้ว แต่หลักปฏิบัติทั่วไปคือ สารละลายตั้งต้นสำหรับงานวิเคราะห์ควรเตรียมใหม่หรือตรวจยืนยันซ้ำ แทนที่จะเชื่อถือไปอย่างไม่มีกำหนด

จัดการผงและสารละลายตั้งต้นเข้มข้นโดยใช้ถุงมือ อุปกรณ์ป้องกันดวงตา เสื้อกาวน์ และวัสดุคลุมโต๊ะปฏิบัติการ พร้อมภาชนะรองรับขวดเพื่อกักการรั่วไหล สีย้อมนี้ทำให้ผิวหนัง เสื้อผ้า โต๊ะปฏิบัติการ และพลาสติกเปื้อนได้รวดเร็ว และเอกสารข้อมูลความปลอดภัยของผู้จำหน่ายจัดประเภทผงว่าเป็นอันตรายหากกลืนกินและระคายเคืองต่อดวงตาและผิวหนัง โดยขึ้นอยู่กับเกรด ข้อควรระวังฉบับเต็มอยู่ใน แนวปฏิบัติในการจัดการและเก็บรักษาอย่างปลอดภัย แต่การควบคุมการเปื้อนเองก็เป็นมาตรการด้านคุณภาพ: สีย้อมที่ตกค้างบนเครื่องแก้วและปิเปตเป็นแหล่งปนเปื้อนข้ามสำหรับการวิเคราะห์สารปริมาณน้อย

ข้อสังเกตเรื่องเกรด

สำหรับอ่างย้อมสีและการสาธิต สารเกรดห้องปฏิบัติการที่สะอาดไม่ว่าเกรดใดก็ใช้งานได้เมื่อเตรียมด้วยความเข้มข้นที่ถูกต้อง สำหรับงานเชิงปริมาณหรือการเปรียบเทียบ เกรดมีความสำคัญเพราะสิ่งเจือปนแตกต่างกัน ได้แก่ Azure B ที่ตกค้างและสารกลุ่มไทอาซีนที่เกี่ยวข้อง โลหะหนัก ตัวทำละลายตกค้าง และปริมาณจุลินทรีย์ ด้วยเหตุนี้ การเลือกเกรดที่มีใบรับรองผลการวิเคราะห์ครบถ้วนรองรับ จึงเป็นส่วนหนึ่งของการเตรียมสาร ไม่ใช่สิ่งที่ค่อยพิจารณาภายหลัง เอกสารประจำล็อตที่ครบถ้วนรายงานเอกลักษณ์สาร ค่าปริมาณสารพร้อมฐานอ้างอิง ปริมาณน้ำ และชุดรายการสิ่งเจือปนที่ทดสอบจริง ทำให้การปรับแก้ตามไฮเดรตในตัวอย่างข้างต้นใช้ค่าที่วัดได้แทนข้อสมมติว่าเป็นไตรไฮเดรตตามที่ระบุ เมื่อสารสองล็อตให้ความเข้มข้นต่างกันจากมวลที่ชั่งเท่ากัน ใบรับรองมักอธิบายเหตุผลได้