เมทิลีนบลูกับความเสื่อมของโครงกระดูกตามวัย: เหตุใดผลในเซลล์จึงไม่ทำนายผลต่อกระดูกหนู

ลองนึกถึงสารประกอบชนิดหนึ่งที่ลดการทำงานของเซลล์ที่สลายกระดูก เมื่อนำไปทดสอบในจานเพาะเลี้ยงก็ได้ผลตรงตามที่หวัง เซลล์ออสทีโอคลาสต์ที่มีหลายนิวเคลียสลดลง การตอบสนองตามขนาดสารชัดเจน และมีคำอธิบายเกี่ยวกับไมโทคอนเดรียที่ฟังดูสมเหตุสมผลรองรับ จากนั้นให้สารชนิดเดียวกันแก่หนูตลอดช่วงส่วนใหญ่ของวัยโตเต็มวัย สแกนโครงกระดูกเป็นภาพสามมิติ แต่กลับไม่พบความแตกต่าง กระดูกที่แก่แล้วก็ยังมีลักษณะแก่ ไม่ว่าจะได้รับสารหรือไม่ก็ตาม

นี่คือภาพของงานวิจัยหนึ่งในปี 2024 ตามที่เป็นจริง และควรทำความเข้าใจให้ชัดเจน เพราะงานนี้อยู่ตรงรอยต่อที่คำกล่าวอ้างส่วนใหญ่เกี่ยวกับอาหารเสริมกับกระดูกมักไปต่อไม่ได้ บทความวิจัยนี้เป็นผลงานของ Poudel และคณะ ตีพิมพ์ใน Aging เมื่อเดือนมีนาคม 2024 และเปิดให้อ่านได้โดยเสรี ดังนั้นค่าที่วัดทั้งหมดด้านล่างจึงตรวจสอบกับต้นฉบับได้ ข้อค้นพบหลักคือไม่พบผล ผลที่ไม่พบความแตกต่างไม่ได้หมายถึงความล้มเหลว แต่เป็นคำตอบ และงานนี้ตอบคำถามเฉพาะได้ดีว่า การให้สารต้านอนุมูลอิสระเมทิลีนบลูหรือไมโตควิโนนทั่วร่างกายเป็นเวลานาน ช่วยคงสภาพโครงกระดูกของหนูที่แก่ลงได้หรือไม่ คำตอบคือไม่

ความเสื่อมของกระดูกตามวัยในรูปของตัวเลข

การสูญเสียกระดูกตามวัยไม่ได้มีเพียงลักษณะเดียว งานวิจัยนี้จึงไม่ได้วัดเพียงอย่างเดียว ผู้วิจัยใช้เอกซเรย์คอมพิวเตอร์ระดับจุลภาคสแกนโครงกระดูก 3 ตำแหน่ง ได้แก่ กระดูกชั้นนอกบริเวณกึ่งกลางลำกระดูกต้นขา (ส่วนลำที่หนาแน่น) กระดูกเนื้อโปร่งบริเวณเมทาฟิซิสปลายล่างของกระดูกต้นขา (โครงข่ายคล้ายฟองน้ำใกล้ข้อ) และกระดูกเนื้อโปร่งในกระดูกสันหลังส่วนเอวข้อที่ 5 แต่ละตำแหน่งมีการบันทึกค่ามาตรฐานของโครงสร้างระดับจุลภาค BV/TV คือสัดส่วนของปริมาตรที่เป็นกระดูกแทนที่จะเป็นช่องไขกระดูก BMD คือความหนาแน่นของแร่ธาตุ Tb.Th, Tb.N และ Tb.Sp อธิบายความหนา จำนวน และระยะห่างของคานกระดูก ส่วนความหนาของกระดูกชั้นนอกและพื้นที่หน้าตัดใช้อธิบายลำกระดูก

ให้นึกถึงกระดูกเนื้อโปร่งเหมือนโครงค้ำยันภายในคลังสินค้า เมื่ออายุมากขึ้น คานบางส่วนหายไปทั้งหมดและส่วนที่เหลือบางลง สัดส่วนของพื้นที่ที่มีโครงสร้างอยู่จึงลดลง คานที่เหลืออยู่ห่างกันมากขึ้น และโครงทั้งหมดรับน้ำหนักได้น้อยลง ส่วนกระดูกชั้นนอกก็เหมือนผนังคลังสินค้าที่บางลงเอง หากการให้สารช่วยปกป้องโครงกระดูกได้จริง ผลควรปรากฏในตัวเลขเหล่านี้ นี่คือเกณฑ์ทดสอบที่งานวิจัยใช้

สิ่งที่เกิดขึ้นในจานเพาะเลี้ยง

การทดลองในเซลล์ใช้ไขกระดูกจากกระดูกต้นขาและกระดูกหน้าแข้งของหนู UM-HET3 อายุ 6 ถึง 7 เดือน ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่มีความหลากหลายทางพันธุกรรมและเพาะขึ้นเพื่อวิจัยเรื่องความชรา ได้ข้อค้นพบ 4 ประการที่ชี้ไปคนละทิศทาง จึงต้องอธิบายแยกกัน

ประการแรก เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์ ซึ่งเป็นกลุ่มเซลล์ที่รวมเซลล์ที่จะพัฒนาเป็นเซลล์สร้างกระดูก ยังคงมีชีวิตอยู่เมื่อสัมผัสเมทิลีนบลูและไมโตควิโนนที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 0.125 ถึง 0.5 micromolar เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ไม่พบพิษต่อเซลล์ และไม่พบการเพิ่มความอยู่รอด ประการที่สอง เมื่อกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเหล่านั้นให้เปลี่ยนเป็นออสทีโอบลาสต์ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ส่งเสริมการสร้างกระดูก แล้วตรวจย้อมอัลคาไลน์ฟอสฟาเทสในวันที่ 18 สารทั้งสองชนิดไม่ทำให้ผลเปลี่ยนไปที่ความเข้มข้นใด ๆ ที่ทดสอบ ด้านการสร้างกระดูกในจานเพาะเลี้ยงจึงไม่ตอบสนอง

ประการที่สาม ด้านการสลายกระดูกตอบสนอง เซลล์ตั้งต้นจากไขกระดูกที่ถูกกระตุ้นด้วย M-CSF และ RANKL ซึ่งเป็นวิธีมาตรฐานในการสร้างออสทีโอคลาสต์ เกิดเป็นเซลล์หลายนิวเคลียสที่ให้ผลบวกต่อ TRAP น้อยลงเมื่อความเข้มข้นเพิ่มขึ้น โดยเห็นการลดลงชัดเจนที่ความเข้มข้นสูงกว่า 0.25 micromolar ซึ่งในชุดการทดลองนี้ก็คือความเข้มข้นสูงสุดที่ทดสอบที่ 0.5 นี่คือข้อค้นพบที่มักนำไปสู่บทสรุปเชิงบวกมากมาย และเป็นผลจริงภายในขอบเขตของมัน นั่นคือ การสัมผัสสารโดยตรงอย่างต่อเนื่องในเซลล์เพาะเลี้ยงยับยั้งการเกิดออสทีโอคลาสต์ตามขนาดสาร

ประการที่สี่ ออสทีโอบลาสต์ที่เจริญเต็มที่ซึ่งสัมผัสสารเป็นเวลา 48 ชั่วโมงและผ่านการทดสอบความเครียดของไมโทคอนเดรีย ไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญของการใช้ออกซิเจนระดับพื้นฐานหรือระดับสูงสุดจากสารชนิดใด ที่ 0.5 micromolar สารทั้งสองดูเหมือนลดการหายใจระดับเซลล์เล็กน้อย แต่การเปลี่ยนแปลงนั้นไม่มีนัยสำคัญ ดังนั้น การทดลองในจานเพาะเลี้ยงจึงไม่พบการฟื้นฟูการทำงานของไมโทคอนเดรียในเซลล์สร้างกระดูกควบคู่กับผลยับยั้งออสทีโอคลาสต์ กลไกที่เสนอไว้ว่าเป็นการปรับปรุงการจัดการพลังงานผ่านห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอนของไมโทคอนเดรีย ไม่ได้ทำให้การหายใจระดับเซลล์เพิ่มขึ้นจนวัดได้ในส่วนที่ผู้วิจัยตรวจสอบ

สิ่งที่เกิดขึ้นในหนู

จากนั้นมีการทดลองในสัตว์ 2 ชุด ซึ่งมีขนาดแตกต่างกันมาก

การทดลองชุดเล็กใช้หนูเพศเมียสายพันธุ์เลือดชิด C57BL/6J ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ใช้กันแพร่หลายในงานวิจัยชีวการแพทย์ เริ่มเมื่ออายุ 18 เดือน ซึ่งเทียบได้คร่าว ๆ กับช่วงปลายวัยกลางคนของหนู ครึ่งหนึ่งดื่มน้ำที่มีเมทิลีนบลู 250 micromolar เป็นเวลา 6 หรือ 12 เดือน จนอายุ 24 หรือ 30 เดือน หนูเพศเมียอายุ 18 เดือนที่ไม่ได้รับสารเป็นกลุ่มอ้างอิงเริ่มต้น และหนูเพศเมียอายุ 5 เดือนแสดงให้เห็นว่ากระดูกอายุน้อยมีลักษณะอย่างไร ความชราทำให้เกิดสิ่งที่เป็นไปตามวัย ในกระดูกสันหลัง L5 สัดส่วนปริมาตรกระดูกลดลงประมาณ 35 เปอร์เซ็นต์ ความหนาแน่นของแร่ธาตุลดลงประมาณ 18 เปอร์เซ็นต์ และจำนวนคานกระดูกลดลงเหลือราวครึ่งหนึ่ง ไม่ว่าจะได้รับสารหรือไม่ ความหนาของกระดูกชั้นนอกลดลงราว 10 เปอร์เซ็นต์ระหว่างอายุ 18 ถึง 24 เดือน และลดลงราว 30 เปอร์เซ็นต์เมื่ออายุ 30 เดือน เมทิลีนบลูไม่ได้เปลี่ยนแนวโน้มใด ๆ เหล่านี้

การทดลองชุดใหญ่ดำเนินการผ่านโครงการ Interventions Testing Program ของ National Institute on Aging ซึ่งทดสอบสารที่มีศักยภาพในหนู UM-HET3 ทั้งสองเพศ ณ สถานที่ทดลอง 3 แห่ง ให้เมทิลีนบลูในอาหารที่ 28 ส่วนในล้านส่วน และไมโตควิโนนที่ 100 ส่วนในล้านส่วน โดยแต่ละชนิดเริ่มให้ตั้งแต่ช่วงต้นวัยโตเต็มวัยและให้ต่อเนื่องจนถึงอายุประมาณ 22 ถึง 24 เดือน โครงกระดูก 3 ตำแหน่งเดิมได้รับการตรวจด้วย micro-CT ตารางที่ตีพิมพ์รายงานค่าทุกตัวแยกตามเพศและการให้สาร พร้อมสถิติที่ปรับแล้ว และคอลัมน์ผลของการให้สารให้คำตอบเหมือนกันทั้งหมด คือไม่พบผลอย่างมีนัยสำคัญ และไม่พบปฏิสัมพันธ์ระหว่างการให้สารกับเพศในตำแหน่งใดเลย ไม่ว่าจะเป็นกระดูกชั้นนอกหรือกระดูกเนื้อโปร่ง กระดูกต้นขาหรือกระดูกสันหลัง เพศผู้หรือเพศเมีย เมทิลีนบลูหรือไมโตควิโนน โครงกระดูกยังคงเสื่อมไปตามวัย

ตารางจับคู่ผลจากทั้งสองส่วน

ตารางนี้คือแกนหลักที่บทความทั้งหมดอ้างอิง แต่ละแถวจับคู่สิ่งที่พบในจานเพาะเลี้ยงกับสิ่งที่พบในสัตว์สำหรับกระบวนการทางชีววิทยาเดียวกัน โดยใช้ค่าที่งานวิจัยวัดเอง

เมื่ออ่านทีละแถว ตารางนี้ช่วยคลี่คลายสิ่งที่ดูขัดแย้งกัน มีเพียง 1 ใน 4 กระบวนการของเซลล์ที่ตอบสนอง และตอบสนองเฉพาะใกล้ระดับสูงสุดของช่วงความเข้มข้นที่ทดสอบ ภายใต้การสัมผัสสารโดยตรงอย่างต่อเนื่อง ทุกอย่างอื่นในจานเพาะเลี้ยงไม่พบผลอยู่แล้ว ผลในสัตว์จึงดูเป็นการยืนยันมากกว่าความขัดแย้ง กล่าวคือ ผลที่ไม่พบความแตกต่าง 3 ประการ บวกกับผลที่เกิดภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ 1 ประการในเซลล์เพาะเลี้ยง กลายเป็นการไม่พบผลในทุกด้านเมื่อทดลองในสัตว์

โครงสร้างกระดูกไม่ใช่อายุขัย

มีความสับสนอย่างหนึ่งที่ควรแยกอธิบาย เพราะเมทิลีนบลูมีข้อมูลเกี่ยวกับอายุขัยจริง และง่ายที่จะอ่านคลาดเคลื่อนว่าเป็นข้อมูลเกี่ยวกับกระดูก ในกลุ่มทดลองก่อนหน้าของ Interventions Testing Program เมทิลีนบลูในอาหารที่ขนาดเดียวกันทำให้อายุขัยที่เปอร์เซ็นไทล์ที่ 90 ของหนู UM-HET3 เพศเมียเพิ่มขึ้นประมาณ 6 เปอร์เซ็นต์ เป็นผลต่อการรอดชีวิตช่วงปลายชีวิต โดยไม่เปลี่ยนแปลงอายุขัยมัธยฐานและไม่พบผลในเพศผู้ ไมโตควิโนนไม่แสดงผลต่ออายุขัยในทั้งสองเพศ ตัวเลขการรอดชีวิตเหล่านี้มาจากข้อมูลอายุขัยที่โครงการเผยแพร่ ไม่ใช่จากบทความวิจัยเรื่องกระดูก

สิ่งที่บทความวิจัยเรื่องกระดูกช่วยทำคือแยกข้อมูลสองชุดนี้ออกจากกัน สารประกอบหนึ่งอาจเปลี่ยนการรอดชีวิตช่วงปลายชีวิตในเพศหนึ่งได้ โดยไม่ได้คงสภาพลักษณะใด ๆ ของโครงกระดูกที่วัดไว้ การรอดชีวิตนับการตายจากทุกสาเหตุ ส่วน micro-CT นับคานในกระดูกสันหลัง ไม่มีกฎว่าการแทรกแซงต้องออกฤทธิ์ผ่านกระดูกจึงจะยืดอายุได้ และงานวิจัยนี้เป็นหลักฐานโดยตรงว่าสัญญาณผลช่วงปลายชีวิตของเมทิลีนบลูในเพศเมียเกิดผ่านเส้นทางอื่น ผู้ที่อ้างผลเรื่องอายุขัยเพื่อสนับสนุนเมทิลีนบลูกับโรคกระดูกพรุนจึงกำลังใช้หลักฐานผิดประเภท หลักทั่วไปในการแยกข้อมูลเหล่านี้ออกจากกันอธิบายไว้ในวิธีอ่านงานวิจัยเมทิลีนบลู

เหตุใดจานเพาะเลี้ยงจึงไม่ทำนายผลในหนู

มีคำอธิบาย 5 ประการที่สอดคล้องกับข้อมูล และแต่ละประการสามารถเกิดร่วมกันได้

ประการแรกคือการสัมผัสสาร เซลล์เพาะเลี้ยงแช่อยู่ในสารอย่างต่อเนื่องที่ความเข้มข้นซึ่งทราบแน่นอน หนูกินอาหารที่ผสมสารนานหลายเดือน แต่งานวิจัยไม่ได้วัดทั้งระดับสารในไขกระดูกและตัวบ่งชี้ความเสียหายจากออกซิเดชันในกระดูก ความเข้มข้นที่ยับยั้งออสทีโอคลาสต์เมื่อให้โดยตรง อาจไม่เคยไปถึงเซลล์ตั้งต้นในไขกระดูกในระดับนั้นเลย บทความนี้ทดสอบสารแต่ละชนิดเพียงขนาดเดียวในสัตว์มีชีวิต ดังนั้นการตอบสนองตามขนาดสารในสัตว์จึงยังไม่ทราบ

ประการที่สองคือเคมี สารออกซิเจนที่ไวต่อปฏิกิริยาไม่ได้อยู่รวมกันเป็นแหล่งเดียวที่ผสมทั่วถึงภายในเซลล์ แต่ทำงานในบริเวณเล็ก ๆ ในช่วงเวลาสั้น ๆ และวงจรรีดอกซ์ในไมโทคอนเดรีย ไซโทซอล และเยื่อหุ้มก็ทำงานแยกกันอยู่บางส่วน ไมโตควิโนนถูกออกแบบให้สะสมในไมโทคอนเดรีย ขณะที่สัญญาณออกซิแดนต์ซึ่งขับเคลื่อนการเกิดออสทีโอคลาสต์อาจเริ่มจากบริเวณอื่น การลดสารในแหล่งหนึ่งจึงไม่จำเป็นต้องให้ผลเหมือนการแช่ทั้งเซลล์ในสารอย่างต่อเนื่อง

ประการที่สามคือการทำงานเชื่อมโยงกัน ในกระดูกที่มีชีวิต การสลายและการสร้างสัมพันธ์กัน ออสทีโอคลาสต์และเซลล์ข้างเคียงส่งสัญญาณเรียกเซลล์สร้างกระดูกมายังบริเวณที่เพิ่งถูกสลาย การยับยั้งการเกิดออสทีโอคลาสต์จึงไม่ได้เพิ่มกระดูกในปริมาณเท่ากัน เพราะอาจลดสัญญาณที่เรียกเซลล์สร้างกระดูกเข้ามาด้วย จานเพาะเลี้ยงที่มีเพียงเซลล์ตั้งต้นไม่สามารถแสดงวงจรป้อนกลับนี้ได้ แต่ในโครงกระดูก ผลของมันย่อมปรากฏ

ประการที่สี่คือการรับแรง ออสทีโอไซต์รับรู้ความเครียดเชิงกลและกำหนดสมดุลการปรับโครงสร้างของกระดูกทั้งชิ้น เมื่อสัตว์แก่ลงและเคลื่อนไหวน้อยลง สัญญาณเชิงกลก็ลดลง และการสูญเสียกระดูกเกิดตามมา แม้จะมีผลทางเภสัชวิทยาระดับเล็กน้อยต่อเซลล์ชนิดหนึ่งก็ตาม ผู้เขียนเองระบุว่าการออกกำลังกายและการรับแรงที่กระตุ้นการสร้างกระดูกน่าจะเป็นปัจจัยที่มีอิทธิพลมากกว่า ซึ่งเป็นวิธีพูดอย่างสุภาพว่าโครงกระดูกตอบสนองต่อฟิสิกส์มากกว่าเคมีรีดอกซ์

ประการที่ห้าคือช่วงเวลาที่เริ่มให้สาร แต่มีข้อจำกัดในการอธิบาย ในการทดลอง C57BL/6J เริ่มให้สารเมื่ออายุ 18 เดือน ซึ่งเกิดการสูญเสียโครงสร้างไปมากแล้ว และสารยับยั้งการสลายกระดูกใด ๆ ก็ไม่สามารถสร้างคานกระดูกที่เป็นรูพรุนและหายไปแล้วกลับคืนมาได้ หากไม่มีการกระตุ้นการสร้างที่สอดคล้องกัน อย่างไรก็ตาม ช่วงเวลาเริ่มต้นไม่สามารถอธิบายทั้งหมดได้ เพราะการให้สารใน Interventions Testing Program เริ่มตั้งแต่ช่วงต้นวัยโตเต็มวัย แต่ก็ยังไม่เปลี่ยนแปลงอะไร การเริ่มช้าอธิบายได้เพียงบางส่วนของการทดลองหนึ่ง และไม่อธิบายผลของอีกการทดลองเลย

ผลเหล่านี้หมายถึงอะไรต่อคำกล่าวอ้างเรื่องเมทิลีนบลูกับโรคกระดูกพรุน

สำหรับผู้อ่านที่กำลังประเมินเมทิลีนบลูในบริบทสุขภาพกระดูกหรือความเสื่อมของโครงกระดูกตามวัย ข้อสรุปเชิงปฏิบัตินั้นสั้นมาก หลักฐานระยะยาวในหนูที่ดีที่สุดที่มีอยู่รายงานว่า การให้เมทิลีนบลูหรือไมโตควิโนนอย่างต่อเนื่องไม่ให้ประโยชน์ต่อโครงกระดูก แม้จะพบสัญญาณการยับยั้งออสทีโอคลาสต์จริงในเซลล์เพาะเลี้ยง งานวิจัยด้านอายุขัยพบผลของเมทิลีนบลูระดับเล็กน้อยในช่วงปลายชีวิตเฉพาะเพศเมีย ซึ่งงานวิจัยนี้แสดงว่าไม่ได้เกิดผ่านกระดูก หลักฐานทั้งสองชุดไม่สนับสนุนการใช้ในมนุษย์สำหรับโรคกระดูกพรุน และไม่มีข้อมูลกระดูกในมนุษย์อยู่ในภาพนี้เลย คำถามเรื่องขนาดการใช้และความปลอดภัยของผลิตภัณฑ์ในมนุษย์อยู่ในความปลอดภัยและผลข้างเคียงของเมทิลีนบลู ไม่ใช่ในผลเรื่องโครงกระดูกหนูนี้

บทเรียนที่ลึกกว่านั้นเกี่ยวกับลำดับของหลักฐาน ผลในเซลล์บอกว่าสารประกอบหนึ่งทำอะไรกับเซลล์ชนิดหนึ่งได้ภายใต้การสัมผัสสารที่ควบคุมไว้ ผลในกระดูกบอกว่าการสัมผัสสารทั่วร่างกายนานหลายเดือนทำอะไรกับอวัยวะที่มีเซลล์สองชนิดทำงานเชื่อมโยงกันภายใต้การควบคุมทางกล ประการแรกคือจุดกำเนิดของสมมติฐาน ส่วนประการที่สองคือจุดที่สมมติฐานนี้ไปต่อไม่ได้ สำหรับความเสื่อมของโครงกระดูกตามวัยและสารต้านอนุมูลอิสระสองชนิดนี้