เมทิลีนบลูกับโรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง: งานวิจัยในสัตว์ทดสอบอะไร

เมื่อค้นหาเมทิลีนบลูสำหรับ MS คุณจะพบงานวิจัยที่ดูเหมือนตอบคำถามเดียวกัน แต่จริง ๆ แล้วไม่ใช่ งานวิจัยฉบับหนึ่งให้เมทิลีนบลูแก่หนูที่ป่วยเพื่อใช้เป็นการรักษา ส่วนอีกฉบับไม่ได้ใช้สารนี้รักษาสัตว์ตัวใดเลย แต่ใช้เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมสีน้ำเงินบนชิ้นเนื้อไขสันหลังบาง ๆ เพื่อให้พยาธิแพทย์มองเห็นไมอีลินด้วยกล้องจุลทรรศน์

นี่คือแนวคิดหลักของบทความทั้งหมด สีย้อมนี้มีสองบทบาทในงานชีววิทยา ซึ่งไม่มีอะไรเหมือนกันนอกจากมาจากขวดเดียวกัน เมื่อใช้เป็นสารที่อาจพัฒนาเป็นยา จะให้สารแก่สัตว์ที่มีชีวิต และคำถามคือโรคเปลี่ยนแปลงหรือไม่ เมื่อใช้เป็นสีย้อม จะนำไปย้อมเนื้อเยื่อที่ไม่มีชีวิตและผ่านการตรึงสภาพแล้วหลังจบการทดลอง และคำถามคือเนื้อเยื่อมีลักษณะอย่างไร หากมองข้ามความแตกต่างนี้ คุณอาจอ่านส่วนวิธีการศึกษาทางพยาธิวิทยาราวกับว่าเป็นผลการรักษา

EAE คืออะไร อธิบายแบบเข้าใจง่าย

ภาวะสมองและไขสันหลังอักเสบจากภูมิคุ้มกันตนเองที่เหนี่ยวนำในการทดลอง ซึ่งมักย่อว่า EAE เป็นแบบจำลองสัตว์มาตรฐานที่ใช้แทนบางแง่มุมของโรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง นักวิจัยกระตุ้นภูมิคุ้มกันในหนูที่ไวต่อการเกิดโรคด้วยชิ้นส่วนของโปรตีนไมอีลินร่วมกับสารเสริมฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่แรง จากนั้นระบบภูมิคุ้มกันจะโจมตีระบบประสาทส่วนกลางของสัตว์เอง หนูเกิดอาการอ่อนแรงที่ลามขึ้นจากส่วนล่าง ซึ่งประเมินได้ง่ายด้วยคะแนน 0 ถึง 5 ตั้งแต่หางอ่อนปวกเปียกไปจนถึงขาหลังเป็นอัมพาต

ความสะดวกในการให้คะแนนนี้อธิบายทั้งเหตุผลที่ EAE เป็นที่นิยมและเหตุผลที่อาจทำให้เข้าใจผิดได้ MS ในมนุษย์เกิดขึ้นเอง มีเป้าหมายของการโจมตีที่หลากหลายกว่าและระบุได้ไม่ชัดเจนเท่า อีกทั้งก่อให้เกิดอาการด้านการมองเห็น การรับความรู้สึก การรู้คิด การทำงานของสมองน้อย และการเคลื่อนไหว โดยมีการดำเนินโรคแบบกำเริบซ้ำหรือแบบลุกลาม EAE จำลองกลไกบางส่วน เช่น การอักเสบ การสูญเสียปลอกไมอีลิน และการบาดเจ็บของแอกซอน ภายใต้สภาวะควบคุม ไม่ได้จำลอง MS ฉบับย่อส่วน ผู้อ่านที่ต้องการกรอบความเข้าใจโดยรวมสามารถทบทวนแนวคิดว่าเมทิลีนบลูออกฤทธิ์ในระดับเซลล์อย่างไร ก่อนประเมินข้อกล่าวอ้างเกี่ยวกับโรคใดโรคหนึ่ง

งานวิจัยสองฉบับด้านล่างยังใช้แอนติเจนสำหรับเหนี่ยวนำ EAE ต่างกันด้วย ซึ่งเป็นเรื่องสำคัญ การศึกษาการรักษาเหนี่ยวนำโรคด้วย MOG35-55 ซึ่งเป็นเปปไทด์สั้นจากไกลโคโปรตีนของโอลิโกเดนโดรไซต์ในไมอีลิน ส่วนการศึกษาพยาธิสภาพเหนี่ยวนำโรคด้วย MP4 ซึ่งเป็นโปรตีนผสมจากส่วนของโปรตีนเบสิกของไมอีลินและโปรตีนโปรตีโอลิพิด การเลือกสายพันธุ์และแอนติเจนส่งผลต่อตำแหน่งที่เกิดรอยโรคและลักษณะการอักเสบ ดังนั้นการศึกษาทั้งสองจึงไม่ใช่การทดลองเดียวกันที่ทำซ้ำสองครั้ง

แผนภาพความเข้าใจ: จากแบบจำลองสู่คำถามและข้อจำกัด

เปิดตารางนี้ไว้ใช้อ้างอิง ตารางนี้เป็นจุดอ้างอิงหลักของบทความ แต่ละแถวระบุว่าแบบจำลองตอบคำถามทางคลินิกใดได้ วัดอะไรจริง และการนำผลไปใช้มีขอบเขตถึงไหน

ผู้ที่ต้องการตรวจสอบพาดหัวข่าวครั้งต่อไปสามารถใช้หัวคอลัมน์เดียวกันนี้ โดยอาศัยแนวทางจากวิธีอ่านงานวิจัยก่อนคลินิก: ถามว่าใช้สัตว์ชนิดใดและแอนติเจนอะไร สารนั้นมีบทบาทใด วัดผลอะไร และผลที่รายงานสะท้อนการดำเนินโรคหรือเพียงภาพของเนื้อเยื่อ ณ ช่วงเวลาหนึ่ง

ผลการรักษา: การให้สารเปลี่ยนอะไร

การศึกษาการรักษาปี 2016 ใน Journal of Neuroimmunology ใช้หนู C57BL/6 เพศเมีย อายุประมาณ 8 ถึง 10 สัปดาห์ โดยกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วย MOG35-55 ปริมาณ 250 ไมโครกรัมต่อหนูหนึ่งตัว หลังเหนี่ยวนำโรค สัตว์ที่เป็น EAE ถูกสุ่มเข้ากลุ่มเมทิลีนบลูหรือกลุ่ม EAE ที่ไม่ได้รับการรักษา และติดตามคะแนนทางคลินิกจนถึงประมาณวันที่ 30

หนูที่ได้รับการรักษามีคะแนนทางคลินิกต่ำกว่าหนูกลุ่มควบคุม EAE อย่างมีนัยสำคัญตั้งแต่วันที่ 15 ถึงวันที่ 30 โดยมีค่า P น้อยกว่า 0.01 การวิเคราะห์ไขสันหลังให้ผลไปในทิศทางเดียวกัน โดยสัตว์ที่ได้รับการรักษามีการแทรกซึมของเซลล์อักเสบน้อยกว่า การสูญเสียปลอกไมอีลินน้อยกว่า และการสูญเสียแอกซอนน้อยกว่า

ส่วนที่โดดเด่นคือชุดการตรวจวัดการส่งสัญญาณ การรักษาเพิ่มการกระตุ้น AMPK และการแสดงออกของ SIRT1 พร้อมทั้งยับยั้งการกระตุ้น NF-kB ซึ่งเป็นตัวควบคุมสำคัญของการอักเสบ ในด้านภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว การรักษาลดการตอบสนองของ Th17 และเพิ่มการตอบสนองของ Treg ดังนั้นลำดับที่เสนอคือ เมทิลีนบลูส่งผลต่อ AMPK และ SIRT1 จากนั้นการส่งสัญญาณ NF-kB ลดลง ตามด้วยการเปลี่ยนจาก Th17 ที่ส่งเสริมการอักเสบไปสู่ Treg ที่ควบคุมภูมิคุ้มกัน ทำให้เนื้อเยื่อบาดเจ็บน้อยลงและคะแนนลดลง

ลำดับนี้เป็นการตีความ ไม่ใช่ลำดับเหตุและผลที่พิสูจน์แล้ว การศึกษาแสดงให้เห็นว่าการให้ยา การเปลี่ยนแปลงของสัญญาณ และภาวะโรคที่ดีขึ้นเกิดขึ้นไปด้วยกัน แต่ไม่ได้พิสูจน์ว่า AMPK และ SIRT1 เป็นตัวกลางของประโยชน์ทั้งหมด และข้อความที่สืบค้นได้จากฐานข้อมูลสาธารณะไม่ได้ระบุขนาดยาเป็นมิลลิกรัมต่อกิโลกรัม วิธีให้ยา วันที่เริ่มให้ หรือระยะเวลาอย่างชัดเจนพอที่จะทำซ้ำแนวทางการให้ยาได้จากบทคัดย่อเพียงอย่างเดียว ควรมองตัวเลขขนาดยาที่หน้าเว็บขายสินค้าอ้างจากงานวิจัยนี้ว่ายังไม่ได้รับการตรวจสอบ เว้นแต่จะอ้างอิงส่วนวิธีการของบทความฉบับเต็ม ฐานหลักฐานเกี่ยวกับเมทิลีนบลูในมนุษย์ที่กว้างกว่านี้เป็นแหล่งที่ควรตรวจสอบว่าสัญญาณทางภูมิคุ้มกันในระยะแรกดังกล่าวพัฒนาไปสู่ข้อมูลทางคลินิกหรือไม่

ผลด้านพยาธิสภาพ: เนื้อเยื่อตลอดหกเดือนแสดงอะไร

การศึกษา MP4 ปี 2015 ใน PLoS ONE ใช้หนู C57BL/6 เพศเมีย โดยกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วย MP4 ปริมาณ 200 ไมโครกรัมในสารเสริมฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันชนิด complete Freund ร่วมกับสารพิษไอกรนในวันที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน และให้สารพิษไอกรนอีกครั้งหลังจากนั้น 48 ชั่วโมง ไม่มีสัตว์ตัวใดได้รับเมทิลีนบลูเป็นยา หลังตรึงสภาพและฝังเนื้อเยื่อในวัสดุรองรับแล้ว ชิ้นเนื้อไขสันหลังแนวขวางหนาหนึ่งไมโครเมตรถูกย้อมด้วยเมทิลีนบลูเพื่อดูด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง และใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนตรวจมัดใยประสาทบริเวณด้านหน้า-ด้านข้างเพื่อดูรายละเอียดที่ละเอียดกว่า

เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อในสามระยะ ได้แก่ ระยะที่อาการเฉียบพลันรุนแรงที่สุดจากหนู 7 ตัว ระยะสามเดือนหลังเริ่มมีอาการจากหนู 5 ตัว และระยะหกเดือนหลังเริ่มมีอาการจากหนู 10 ตัว คะแนนทางคลินิกเฉลี่ยในแต่ละระยะดูแทบไม่ต่างกัน อยู่ใกล้ 1.7 ถึง 1.8 บนมาตราส่วน 0 ถึง 5 แต่เนื้อเยื่อสะท้อนเรื่องราวอีกแบบหนึ่ง ความเสียหายเฉพาะไมอีลินเพิ่มจากประมาณ 569,000 เส้นใยต่อตารางมิลลิเมตรในระยะเฉียบพลันที่รุนแรงที่สุด เป็นประมาณ 1,496,000 ที่หกเดือน โดยการเปรียบเทียบระหว่างระยะเฉียบพลันกับระยะยาวมีนัยสำคัญที่ค่า P เท่ากับ 0.027 ความเสียหายที่เกิดทั้งกับไมอีลินและแอกซอนเพิ่มขึ้นประมาณสองเท่าเมื่อถึงหกเดือน เส้นใยที่กำลังสร้างปลอกไมอีลินใหม่มีสัดส่วนต่ำกว่าหนึ่งเปอร์เซ็นต์ในทุกระยะ ซึ่งเป็นรายละเอียดที่ชวนให้ระมัดระวังความหวังเรื่องการซ่อมแซม

การบาดเจ็บของแอกซอนมีรูปแบบเป็นรูปตัวยู โดยสูงในระยะเฉียบพลันที่รุนแรงที่สุด ลดลงที่สามเดือน และสูงที่สุดที่หกเดือน ทั้งยังสัมพันธ์กับการบวมของไมโทคอนเดรียและระยะห่างระหว่างนิวโรฟิลาเมนต์ที่ลดลง ผู้ประเมินไม่ทราบคะแนนและระยะของโรค ซึ่งเพิ่มน้ำหนักให้การตีความว่าคะแนนทางคลินิกสะท้อนความเสียหายเชิงโครงสร้างที่ดำเนินต่อไปได้ไม่ครบถ้วน

ความไม่สอดคล้องนี้คือข้อค้นพบสำคัญของการศึกษาสำหรับผู้อ่านที่สนใจ MS คะแนนความพิการที่คงที่ไม่ได้หมายความว่าเนื้อเยื่อมีสภาพคงที่ และยังแสดงด้วยว่าเหตุใดงานวิจัยนี้จึงไม่สามารถสนับสนุนข้อกล่าวอ้างใด ๆ เกี่ยวกับการรักษา MS ด้วยเมทิลีนบลูได้ เพราะสิ่งที่ศึกษาคือการเปลี่ยนแปลงตามเวลา ไม่ใช่การรักษา

เหตุใดทั้งสองการศึกษาจึงยังไม่ยืนยันประโยชน์ในผู้ป่วย

ให้มองว่างานวิจัยแต่ละฉบับตอบคำถามเฉพาะได้ดี แต่ไม่ได้ตอบคำถามเกี่ยวกับผู้ป่วยเลย

ประการแรก สาเหตุแตกต่างกัน EAE ถูกเหนี่ยวนำโดยตั้งใจด้วยแอนติเจนที่กำหนดไว้และสารเสริมฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกัน ส่วน MS ในมนุษย์เกิดขึ้นเอง โดยเกี่ยวข้องกับองค์ประกอบของภูมิคุ้มกันที่หลากหลายกว่า ทั้งเซลล์ T เซลล์ B ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด และเซลล์เกลียประจำถิ่น สารที่เปลี่ยนการตอบสนองซึ่งเน้น MOG ในหนูอาจไม่ได้เปลี่ยนการตอบสนองที่กว้างกว่านั้นในมนุษย์

ประการที่สอง ลักษณะอาการแตกต่างกัน อาการอ่อนแรงที่ลามจากหางไปยังขาหลังในหนูเป็นตัวชี้วัดที่สะดวก แต่เป็นการย่อความหลากหลายของ MS ในมนุษย์ให้เหลือเพียงตัวเลขด้านการเคลื่อนไหวหนึ่งค่า ยามักเปลี่ยนคะแนน EAE ในระยะสั้นได้โดยไม่เปลี่ยนการดำเนินโรคในมนุษย์ นี่จึงเป็นเหตุผลที่ EAE เป็นเครื่องมือคัดกรองและศึกษากลไก ไม่ใช่คลินิกฉบับย่อส่วน

ประการที่สาม ระดับการได้รับสารและช่วงเวลายังไม่ชัดเจน การให้สารอย่างต่อเนื่องตั้งแต่ระยะแรกในการทดลองกับหนู 30 วันไม่เหมือนการรับประทานเรื้อรังในคนที่เป็นโรคอยู่แล้ว และทั้งสองการศึกษาไม่ได้วัดระดับยาในระบบประสาท หากขาดข้อมูลเชื่อมโยงนี้ ก็ไม่มีสะพานเชื่อมจากความเข้มข้นบนจานทดลองหรือขนาดยาในหนูไปสู่แนวทางการให้ยาในมนุษย์

ประการที่สี่ งานวิจัยสองฉบับไม่ได้ทำซ้ำเพื่อยืนยันผลของกันและกัน ทั้งแอนติเจน คำถาม และตัวชี้วัดผลต่างกัน อีกทั้งฉบับหนึ่งไม่ได้ทดสอบการรักษาเลย การอ้างสองฉบับนี้ร่วมกันว่าเป็นการศึกษาการรักษา MS ที่ให้ผลเชิงบวกสองงานจึงเป็นการจัดประเภทผิด

สิ่งนี้หมายความอย่างไรสำหรับผู้อ่านที่กำลังชั่งน้ำหนักหลักฐาน

งานวิจัยเหล่านี้ไม่ได้กำหนดแนวทางการใช้เมทิลีนบลูสำหรับ MS ที่ได้รับการยืนยัน การศึกษาการรักษาสนับสนุนให้วิจัยต่อเกี่ยวกับ AMPK, SIRT1, NF-kB และสมดุลระหว่าง Th17 กับ Treg ใน MOG EAE ส่วนการศึกษาพยาธิสภาพเตือนว่าเนื้อเยื่ออาจเสียหายมากขึ้นแม้คะแนนดูคงที่ และเมทิลีนบลูในส่วนวิธีการบางครั้งหมายถึงขวดสีย้อม ไม่ใช่ยาสำหรับรักษา ผู้อ่านที่ติดตามงานวิจัยโรคปลอกประสาทเสื่อมแข็งที่กำลังดำเนินอยู่ ควรจดจำความแตกต่างระหว่างสีย้อมกับยานี้ไว้ คำถามด้านความปลอดภัย รวมถึงความเสี่ยงต่อเลือดและปฏิกิริยาระหว่างยา ควรนำไปพูดคุยกับแพทย์ควบคู่กับข้อมูลความปลอดภัยทั่วไปของเมทิลีนบลู ก่อนที่ใครจะตัดสินใจลงมือทำตามพาดหัวข่าวจากห้องปฏิบัติการ

ใจความสำคัญสรุปได้ในประโยคเดียวว่า การศึกษาที่ถูกอ้างฉบับหนึ่งให้เมทิลีนบลูแก่หนู MOG EAE และรายงานว่าโรครุนแรงน้อยลงพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงของภูมิคุ้มกันไปในทิศทางลดการอักเสบ ขณะที่อีกฉบับไม่ได้ให้สารใดเพื่อการรักษาและใช้เมทิลีนบลูเพียงเพื่อย้อมไขสันหลังขณะบันทึกความเสียหายของไมอีลินและแอกซอนที่สะสมตลอดหกเดือน ดังนั้นงานวิจัยคู่นี้จึงไม่ได้ยืนยันว่าเมทิลีนบลูช่วยผู้ป่วย MS ในมนุษย์ได้