เมทิลีนบลูกับเฟอร์รอปโทซิส: เหล็ก การเกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิด และการตายของเซลล์

เฟอร์รอปโทซิสคือการตายของเซลล์จากความเสียหายของเยื่อหุ้ม ไขมันไม่อิ่มตัวหลายตำแหน่งในเยื่อหุ้มเกิดออกซิเดชันเป็นปฏิกิริยาลูกโซ่ เยื่อหุ้มสูญเสียหน้าที่ และเซลล์ตาย กระบวนการทางเคมีนี้ต้องอาศัยเหล็ก ข้อความนี้สรุปแนวคิดทั้งหมด และทุกส่วนของบทความนี้คือการทดสอบองค์ประกอบหนึ่งของแนวคิดดังกล่าว

คำถามในที่นี้เจาะจงกว่านั้น: เมทิลีนบลูทำอะไรกับปฏิกิริยาลูกโซ่นี้ในการทดลองในเซลล์ และผลที่ได้นั้นแสดงให้เห็นอะไรจริง ๆ คำตอบสั้น ๆ คือ ในงานวิจัยในห้องปฏิบัติการสองชิ้น เมทิลีนบลูที่ความเข้มข้นระดับนาโนโมลาร์ลดการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิดในไมโทคอนเดรีย และทำให้เซลล์ยังมีชีวิตหลังได้รับตัวกระตุ้นที่ตามปกติทำให้เกิดเฟอร์รอปโทซิส คำตอบที่ยาวกว่านั้นสำคัญกว่า เพราะแต่ละขั้นในปฏิกิริยาลูกโซ่ถูกทดสอบด้วยวิธีแทรกแซงที่ต่างกัน และแต่ละวิธีก็มีข้อจำกัด

เฟอร์รอปโทซิสในหนึ่งย่อหน้า

ฟอสโฟลิพิดในเยื่อหุ้มที่มีหางเป็นกรดไขมันไม่อิ่มตัวหลายตำแหน่งมีจุดอ่อนอยู่ที่อะตอมไฮโดรเจนซึ่งถูกดึงออกได้ง่าย เมื่ออนุมูลดึงไฮโดรเจนออกไปหนึ่งอะตอม ออกซิเจนจะเข้าจับกับลิพิด เกิดเป็นอนุมูลลิพิดเปอร์ออกซิล และอนุมูลนั้นจะดึงไฮโดรเจนจากลิพิดตัวถัดไป ปฏิกิริยาจึงแพร่ต่อไปตามเยื่อหุ้ม เว้นแต่จะมีบางสิ่งหยุดมัน

กลไกหยุดปฏิกิริยาหลักคือเอนไซม์ชื่อ GPX4 ซึ่งใช้กลูตาไธโอนรีดิวซ์ลิพิดเปอร์ออกไซด์ให้เป็นลิพิดแอลกอฮอล์ที่ไม่เป็นอันตราย ตัวกระตุ้นในห้องปฏิบัติการโจมตีระบบป้องกันนี้ในจุดที่กำหนดไว้ Erastin ขัดขวางการนำซิสทีนเข้าสู่เซลล์ผ่านระบบ xc-minus ทำให้เซลล์ขาดซิสเทอีนสำหรับสังเคราะห์กลูตาไธโอน Buthionine sulfoximine ขัดขวางการสังเคราะห์กลูตาไธโอนโดยตรง ส่วน RSL3 ยับยั้ง GPX4 เอง ทั้งสามทำให้เปอร์ออกไซด์ไม่ถูกกำจัด แต่ทำผ่านคนละขั้นตอน ดังนั้นผลที่ได้จากตัวกระตุ้นหนึ่งจึงไม่สามารถนำไปใช้กับตัวกระตุ้นอื่นได้โดยอัตโนมัติ

เฟอร์รอปโทซิสต่างจากอะพอพโทซิสในลักษณะที่ใช้จำแนกกระบวนการนี้ โดยไม่มีปฏิกิริยาต่อเนื่องของแคสเปสและไม่มีชิ้นส่วนเซลล์แบบอะพอพโทซิส สารคีเลตเหล็ก เช่น deferoxamine และสารดักจับอนุมูล เช่น ferrostatin-1 สามารถยับยั้งกระบวนการนี้ได้ นักวิจัยใช้การทดสอบดังกล่าวเป็นเกณฑ์เชิงปฏิบัติในการระบุว่าการตายนั้นเป็นเฟอร์รอปโทซิส ไม่ใช่เพียงเนโครซิส ภาพรวมของเส้นทางการตายของเซลล์ที่มีการควบคุมช่วยให้เข้าใจความแตกต่างนี้ในบริบทที่กว้างขึ้น และวิธีที่เซลล์จัดการกับเหล็กที่พร้อมเข้าร่วมปฏิกิริยาก็อธิบายได้ว่าทำไมการคีเลตจึงเป็นชุดควบคุมที่ชี้ขาดเช่นนี้

ไมโทคอนเดรียมีบทบาทตรงไหน และเหตุใดจึงเป็นข้อถกเถียง

งานวิจัยระยะแรกรายงานว่าเซลล์ที่ไม่มีดีเอ็นเอของไมโทคอนเดรียยังเกิดเฟอร์รอปโทซิสได้ ซึ่งบ่งชี้ว่าไมโทคอนเดรียอาจไม่ใช่องค์ประกอบจำเป็น งานวิจัยต่อมาพบว่าการลดจำนวนไมโทคอนเดรียหรือการขัดขวางการหายใจระดับเซลล์สามารถยับยั้งเฟอร์รอปโทซิสจากการขาดซิสเทอีนได้ แต่ไม่สามารถยับยั้งเฟอร์รอปโทซิสจากการยับยั้ง GPX4 โดยตรง ผลทั้งสองอาจถูกต้องได้ หากบทบาทของไมโทคอนเดรียขึ้นอยู่กับตัวกระตุ้น ชนิดเซลล์ และตำแหน่งที่เกิดเปอร์ออกซิเดชันซึ่งเป็นจุดชี้ขาด

งานวิจัยหลักที่บทความนี้อ้างอิงใช้โพรบที่จำเพาะต่อบริเวณภายในเซลล์เพื่อศึกษาข้อถกเถียงนี้ MitoCLox เป็นตัวรายงานการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิดรุ่นที่มุ่งเป้าไปยังไมโทคอนเดรีย โดยสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์จะเปลี่ยนไปเมื่อสัมผัสกับอนุมูลลิพิดเปอร์ออกซิลภายในไมโทคอนเดรีย ในไฟโบรบลาสต์ที่ได้รับ erastin พบการออกซิเดชันของโพรบในไมโทคอนเดรียขณะเซลล์ยังมีชีวิต ก่อนที่จะตาย และระดับการออกซิเดชันแตกต่างกันระหว่างเซลล์ในกลุ่ม ลำดับเวลานี้มีความสำคัญ การเกิดเปอร์ออกซิเดชันก่อนเซลล์ตายอาจเป็นสาเหตุหนึ่งของการตาย ส่วนเปอร์ออกซิเดชันที่ตรวจพบเฉพาะในเซลล์ที่ตายแล้วเป็นเพียงซากที่หลงเหลือ คู่มือประกอบเรื่องการทดสอบเปอร์ออกซิเดชันของลิพิดและสิ่งที่โพรบแต่ละชนิดรายงาน อธิบายว่าทำไมตำแหน่งของโพรบจึงเป็นตัวกำหนดความหมายของสัญญาณ

รูปแบบเดียวกันปรากฏในแบบจำลองที่สอง ไฟโบรบลาสต์จากผู้ป่วยโรคเส้นประสาทตาเสื่อมทางพันธุกรรมชนิด Leber ซึ่งมีการกลายพันธุ์ของคอมเพล็กซ์ I และมีภาวะเครียดออกซิเดชันพื้นฐานสูงกว่า ตายแบบเฟอร์รอปโทซิสเมื่อกลูตาไธโอนลดลง ขณะที่ไฟโบรบลาสต์กลุ่มควบคุมทนต่อภาวะนี้ได้ การออกซิเดชันของโพรบในไมโทคอนเดรียเกิดขึ้นก่อนอีกเช่นกัน รายละเอียดอยู่ในงานวิจัยไฟโบรบลาสต์เกี่ยวกับเปอร์ออกซิเดชันของลิพิดในไมโทคอนเดรียระหว่างเฟอร์รอปโทซิส

เมทิลีนบลูเปลี่ยนแปลงอะไรในการทดลองเหล่านี้

เมทิลีนบลูเป็นตัวพารีดอกซ์ รูปออกซิไดซ์ของมันรับอิเล็กตรอนจากกระบวนการทางเคมีที่เชื่อมโยงกับ NADH ณ คอมเพล็กซ์ I และรูปรีดิวซ์ส่งอิเล็กตรอนให้ไซโตโครม c ซึ่งส่งต่อไปยังคอมเพล็กซ์ IV จึงเกิดทางเลี่ยงบางส่วนรอบช่วงของห่วงโซ่ที่อิเล็กตรอนตามปกติรั่วไปสู่ออกซิเจนจนเกิดซูเปอร์ออกไซด์ ผู้อ่านที่ต้องการเห็นภาพการส่งต่อทั้งหมดควรเริ่มจากเมทิลีนบลูเคลื่อนย้ายอิเล็กตรอนผ่านไมโทคอนเดรียอย่างไร

ในไฟโบรบลาสต์จากปอดที่ได้รับ erastin เมทิลีนบลูที่ 250 nanomolar ช่วยคงการมีชีวิตของเซลล์ตามผลการตรวจวัดการรอดชีวิต เช่นเดียวกับสารต้านอนุมูลอิสระที่มุ่งเป้าไปยังไมโทคอนเดรีย ได้แก่ SkQ1 และ MitoTEMPO ชุดควบคุมเป็นตัวกำหนดขอบเขตของข้อสรุป Ferrostatin-1, alpha-tocopherol และ deferoxamine ก็ให้ผลป้องกันเช่นกัน ซึ่งยืนยันว่าการตายเป็นแบบเฟอร์รอปโทซิส สารอนาล็อกของ SkQ1 ที่ไม่มีกลุ่มต้านอนุมูลอิสระไม่ให้ผลป้องกัน จึงชี้ไปที่กระบวนการทางเคมีรีดอกซ์ ไม่ใช่การสะสมที่ไม่จำเพาะ ผลป้องกันลดลงเมื่อ SkQ1 มีความเข้มข้นสูงกว่าโดยประมาณ 200 nanomolar ซึ่งสอดคล้องกับพฤติกรรมส่งเสริมออกซิเดชันที่ทราบกันของสารต้านอนุมูลอิสระกลุ่มควิโนนเมื่อมีปริมาณสูงขึ้น เมทิลีนบลูก็มีพฤติกรรมสองด้านตามระดับความเข้มข้นเช่นเดียวกัน โดยให้ผลป้องกันที่ระดับนาโนโมลาร์ต่ำในจานเพาะเลี้ยงเหล่านี้ แต่สามารถสร้างไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ผ่านวัฏจักรรีดอกซ์เมื่อเพิ่มความเข้มข้นหรือได้รับแสงเข้ม บริบทเรื่องระดับความเข้มข้นเช่นนี้อธิบายไว้ในชนิดออกซิเจนที่ไวต่อปฏิกิริยาในไมโทคอนเดรีย

จากนั้น การทดลองในไมโทคอนเดรียที่แยกออกมาได้แยกแหล่งกำเนิด ROS ออกจากกัน เมื่อมีเหล็กเฟอร์รัสอยู่ สารตั้งต้นที่ป้อนอิเล็กตรอนให้คอมเพล็กซ์ I ร่วมกับ rotenone กระตุ้นการออกซิเดชันของโพรบ Rotenone ขัดขวางการส่งอิเล็กตรอนในตำแหน่งถัดจากจุดฟลาวิน ทำให้ตัวพาที่อยู่ก่อนหน้านั้นคงสภาพรีดิวซ์และปล่อยอิเล็กตรอนรั่วไปสู่ออกซิเจนจากฟลาวินด้านที่หันเข้าหาเมทริกซ์ สารตั้งต้นที่ป้อนอิเล็กตรอนให้คอมเพล็กซ์ III ร่วมกับ antimycin A สร้างไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์จำนวนมาก แต่ไม่ได้ขับเคลื่อนการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิด สัญญาณ ROS โดยรวมเหมือนกัน แต่ตำแหน่งต่างกันและผลลัพธ์ต่างกัน ทั้ง SkQ1 และเมทิลีนบลูยับยั้งเปอร์ออกซิเดชันที่ขับเคลื่อนโดยคอมเพล็กซ์ I โดยไม่ได้ยับยั้งการสร้างไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เอง จึงระบุได้ว่าการออกฤทธิ์ของทั้งสองอยู่หลังการสร้าง ROS ณ ขั้นตอนการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิด

การทดลองด้านเหล็กเกินและเบาะแสจากไลโปฟัสซิน

งานวิจัยชิ้นที่สองตั้งคำถามจากด้านของเหล็ก เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ H9c2 ที่ได้รับเฟอร์ริกแอมโมเนียมซิเตรตในระดับต่ำกว่ามิลลิโมลาร์เกิด ROS ในไมโทคอนเดรีย เกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิดในไมโทคอนเดรีย แล้วเกิดเฟอร์รอปโทซิส ตามด้วยการสะสมของเม็ดสีคล้ายไลโปฟัสซินภายใน 24 hours ไลโปฟัสซินคือสารตกค้างจากลิพิดและโปรตีนที่ถูกออกซิไดซ์ มีเหล็กเป็นองค์ประกอบและเรืองแสงได้เอง ซึ่งสะสมมากขึ้นตามอายุ การปรากฏอย่างรวดเร็วในที่นี้จึงเชื่อมโยงเปอร์ออกซิเดชันเฉียบพลันที่ขับเคลื่อนด้วยเหล็กเข้ากับตัวบ่งชี้ความชราที่รู้จักกันมานาน ทั้งเมทิลีนบลูระดับนาโนโมลาร์และ SkQ1 ต่างป้องกันการเกิดเปอร์ออกซิเดชัน การตาย และการสะสมของเม็ดสีได้ ไมโทคอนเดรียจากหัวใจที่แยกออกมายืนยันรูปแบบนี้: rotenone ร่วมกับเหล็กเฟอร์รัสขับเคลื่อนเปอร์ออกซิเดชันและสัญญาณคล้ายเม็ดสี และสารทั้งสองขัดขวางสิ่งเหล่านี้ได้ ลำดับเหตุการณ์ทั้งหมดรายงานไว้ในงานวิจัยภาวะเหล็กเกินในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ H9c2 ส่วนเรื่องเม็ดสีเกี่ยวข้องกับไลโปฟัสซินและตัวบ่งชี้ความชราของเซลล์

สิ่งที่การทดสอบการรอดชีวิตของเซลล์ไม่ได้แสดง

ผลการตรวจวัดความมีชีวิต เช่น CellTiterBlue รายงานว่ามีเซลล์ในจานเพาะเลี้ยงจำนวนเท่าใดที่ยังมีกิจกรรมทางเมแทบอลิซึมหลังได้รับตัวกระตุ้นร่วมกับสารที่อาจให้ผลป้องกัน นี่คือการทดสอบกลไกในระบบที่กำหนดไว้ ไม่ใช่ผลลัพธ์การรักษา ไม่มีการทดลองใดในกลุ่มนี้ที่ให้สารแก่ผู้ป่วย วัดผลลัพธ์ปลายทางของโรค หรือกำหนดช่วงการใช้เพื่อการรักษาในร่างกาย

มีข้อจำกัดสี่ประการที่ควรระบุอย่างชัดเจน ประการแรก ชนิดเซลล์มีขอบเขตแคบ ได้แก่ ไฟโบรบลาสต์จากปอดที่ผ่านการทรานส์ฟอร์ม ไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิจากผิวหนังซึ่งรวมสายเซลล์ที่มีโรคไมโทคอนเดรียหนึ่งสาย และสายเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจของหนูแรท รวมถึงไมโทคอนเดรียจากหัวใจหนูแรทที่แยกออกมา ความไวแตกต่างกันตามสายเซลล์ และสายเซลล์ LHON ถูกเลือกให้มีความเปราะบางสูงผิดปกติตามการออกแบบการทดลอง ประการที่สอง ตัวกระตุ้นเป็นสภาวะสุดขั้วในห้องปฏิบัติการ ได้แก่ การขัดขวางการขนส่งหรือการสังเคราะห์อย่างสมบูรณ์ และปริมาณเหล็กที่ไม่มีเนื้อเยื่อใดจะเผชิญแบบเฉียบพลัน ประการที่สาม ความเข้มข้นไม่สามารถแปลงเป็นขนาดใช้ได้ด้วยการคูณ ระดับนาโนโมลาร์ในอาหารเลี้ยงเซลล์ไม่ใช่ขนาดใช้ในมนุษย์ และการกระจายตัวของเมทิลีนบลู การรีดิวซ์เป็นรูปไร้สีในเลือดและเนื้อเยื่อ การได้รับแสง และศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้ม ล้วนเป็นปัจจัยที่คั่นอยู่ระหว่างจานเพาะเลี้ยงกับคน ประการที่สี่ โพรบรายงานเฉพาะบริเวณที่มันอยู่ การออกซิเดชันของ MitoCLox แสดงว่าเกิดอนุมูลลิพิดในไมโทคอนเดรีย แต่ไม่ได้แสดงว่าการแตกของเยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่งน่าจะเป็นเหตุการณ์สุดท้าย ถูกป้องกันโดยตรง แทนที่จะเป็นผลจากการหลีกเลี่ยงกระบวนการก่อนหน้า

ดังนั้น ข้อสรุปที่ตรงไปตรงมาคือ ในแบบจำลองเหล่านี้ ROS ที่มาจากคอมเพล็กซ์ I ร่วมกับเหล็กขับเคลื่อนการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของลิพิดในไมโทคอนเดรียซึ่งเกิดก่อนเฟอร์รอปโทซิส และเมทิลีนบลูที่ความเข้มข้นต่ำขัดขวางช่วงดังกล่าวของกระบวนการ ข้อสรุปใดที่เกินกว่าช่วงนี้ต้องอาศัยการทดลองแบบอื่นในสัตว์ แล้วจึงศึกษาในคน