เมทิลีนบลูสามารถข้ามคอมเพล็กซ์ III ของไมโทคอนเดรียได้หรือไม่? เหตุใดผลการศึกษาจึงขัดแย้งกัน

ห้องปฏิบัติการสองแห่งตั้งคำถามว่าเมทิลีนบลูสามารถข้ามคอมเพล็กซ์ III ของไมโทคอนเดรียที่ถูกยับยั้งได้หรือไม่ แห่งหนึ่งตอบว่าไม่ได้ อีกแห่งตอบว่าได้ ทั้งสองแห่งมีข้อมูลรองรับ

การศึกษาแรกในไมโทคอนเดรียจากสมองหนูเมาส์พบว่าสีย้อมนี้ทำไม่ได้ การศึกษาที่สองในไมโทคอนเดรียจากสมองสัตว์ฟันแทะสามชนิดพบว่าทำได้บางส่วน ส่วนการศึกษาที่สามในตับหนูเมาส์มักถูกอ้างถึงร่วมกัน แต่ทดสอบคนละเรื่อง หากแยกบทบาทของงานนี้ให้ถูกต้อง ความสับสนก็จะลดลงไปครึ่งหนึ่ง

ยังไม่มีกลไกที่ใช้ได้กับทุกกรณีให้ประกาศเป็นข้อสรุป มีเพียงการทดลองสามงานที่ใช้สารยับยั้ง ปริมาณ และตัวชี้วัดต่างกัน อ่านเงื่อนไขก่อน แล้วจึงพิจารณาข้อสรุป

การข้ามในที่นี้หมายถึงอะไร

อิเล็กตรอนเข้าสู่ห่วงโซ่ผ่านคอมเพล็กซ์ I (จาก NADH) หรือคอมเพล็กซ์ II (จากซักซิเนต) ผ่านคอมเพล็กซ์ III ไปยังไซโตโครม c แล้วผ่านคอมเพล็กซ์ IV ไปยังออกซิเจน ความต่างศักย์ที่สร้างขึ้นระหว่างทางคือสิ่งที่เซลล์ใช้ในการสร้าง ATP

ข้อเสนอเรื่องการข้ามหมายความว่าเมทิลีนบลูรับอิเล็กตรอนจากตำแหน่งก่อนจุดที่ถูกยับยั้ง แล้วส่งต่อไปยังตำแหน่งหลังจุดนั้น สีย้อมในรูปออกซิไดซ์รับอิเล็กตรอนจาก NADH หรือองค์ประกอบช่วงต้นของห่วงโซ่ แล้วกลายเป็นลิวโคเมทิลีนบลู จากนั้นรูปรีดิวซ์จะส่งอิเล็กตรอนให้ไซโตโครม c หรือส่งกลับเข้าห่วงโซ่ หากส่งต่อไปยังตำแหน่งหลังจุดที่ถูกยับยั้ง การหายใจและศักย์เยื่อหุ้มจะฟื้นกลับมาบางส่วน หากส่งต่อที่จุดยับยั้งหรือก่อนจุดนั้น ก็จะไม่มีการฟื้นกลับ

รายละเอียดหนึ่งของคอมเพล็กซ์ III มีบทบาทสำคัญต่อข้อถกเถียงนี้ คอมเพล็กซ์นี้ทำงานผ่านวัฏจักร Q ซึ่งมีตำแหน่งจับสารยับยั้งสองแห่ง แอนติไมซินจับที่ตำแหน่ง Qi ส่วนไมโซไทอะซอลจับที่ตำแหน่ง Qo การศึกษาที่ใช้สารเพียงตัวใดตัวหนึ่งจึงทดสอบคอมเพล็กซ์เพียงครึ่งเดียว

การศึกษาแรก: ไม่พบการข้ามในไมโทคอนเดรียจากสมองหนูเมาส์

Gureev และคณะใช้ไมโทคอนเดรียจากเปลือกสมองของหนูเมาส์ C57BL/6 แยกด้วยดิจิโทนิน และทดสอบที่ความเข้มข้นโปรตีน 0.1 mg per ml สารตั้งต้นแบ่งเป็นสามชุด ได้แก่ ไพรูเวตร่วมกับมาเลตอย่างละ 5 mM, ซักซิเนต 10 mM ร่วมกับกลูตาเมต 2 mM และ L-โพรลีน 10 mM สารยับยั้งคือโรทีโนน 1 micromolar (คอมเพล็กซ์ I) และแอนติไมซิน 1 microgram per ml (คอมเพล็กซ์ III) ปริมาณสีย้อมคือ 0.5, 1 และ 2 micromolar โดยใช้ 1 micromolar เป็นความเข้มข้นหลัก วิธีการและกราฟสัญญาณอยู่ในบทความสั้นใน FEBS Letters

การข้ามคอมเพล็กซ์ I ได้ผล โรทีโนนลดการหายใจที่กระตุ้นด้วย ADP จากประมาณ 121 เหลือประมาณ 2 nmol per minute per mg และสีย้อม 1 micromolar ทำให้กลับขึ้นมาประมาณ 21 ศักย์เยื่อหุ้มฟื้นกลับเมื่อใช้ไพรูเวตร่วมกับมาเลต และเมื่อใช้ L-โพรลีน

การข้ามคอมเพล็กซ์ III ไม่ได้ผล แอนติไมซินลดการหายใจเหลือประมาณ 16 และสีย้อมเพิ่มขึ้นได้เพียงประมาณ 20 ศักย์เยื่อหุ้มไม่ฟื้นกลับไม่ว่าจะใช้สารตั้งต้นชนิดใด แม้ใช้สีย้อมสูงถึง 5 micromolar ข้อมูลเปอร์ออกไซด์ชี้ไปในทิศทางเดียวกัน สีย้อมเพียงอย่างเดียวเพิ่มการปล่อยเปอร์ออกไซด์จากอัตราพื้นฐานใกล้ 76 pmol per minute per mg เป็นประมาณ 1170, 1460 และ 1945 ตามปริมาณทั้งสามระดับ แต่แอนติไมซินลดสัญญาณที่เกิดจากสีย้อมนี้ลงประมาณ 25, 88 และ 96 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ หากสีย้อมในรูปรีดิวซ์ทำปฏิกิริยากับออกซิเจนโดยตรง การยับยั้งคอมเพล็กซ์ III ไม่ควรลดสัญญาณนี้ ผู้เขียนจึงอนุมานว่าสีย้อมในรูปรีดิวซ์ถูกออกซิไดซ์ที่ตำแหน่ง Qo ของคอมเพล็กซ์ III ซึ่งอยู่ก่อนจุดที่แอนติไมซินยับยั้ง สรุปเส้นทางวนสั้น ๆ ได้ว่า ผู้ให้อิเล็กตรอนส่งให้สีย้อม สีย้อมส่งไปยัง Qo แล้วเดินทางต่อไปตามเส้นทางปกติ จึงข้ามการยับยั้งด้วยโรทีโนนได้ แต่ข้ามการยับยั้งด้วยแอนติไมซินไม่ได้

การศึกษาที่สอง: ข้ามได้บางส่วนในสัตว์สามชนิด ที่ตำแหน่งยับยั้งทั้งสองแห่ง

Svab และคณะขยายการออกแบบการทดลอง โดยใช้ไมโทคอนเดรียจากสมองหนูเมาส์ หนูแรต และหนูตะเภา แยกด้วย Percoll และทดสอบที่ความเข้มข้นเดียวกันคือ 0.1 mg per ml ใช้ไพรูเวตร่วมกับมาเลต หรือกลูตาเมตร่วมกับมาเลต อย่างละ 5 mM ใช้สารยับยั้งคอมเพล็กซ์ III สองชนิด ได้แก่ แอนติไมซิน A 0.3 micromolar และไมโซไทอะซอล 1 micromolar สีย้อมมีความเข้มข้น 2 micromolar ในการทดสอบส่วนใหญ่ และ 0.5 ในการทดสอบไซโตโครม c ข้อมูลของสัตว์ทั้งสามชนิดที่ใช้วิธีทดลองตรงกันอยู่ในบทความที่เปิดให้อ่านได้ฟรี

การยับยั้งทั้งสองแบบถูกข้ามได้บางส่วนในสัตว์ทั้งสามชนิด ในไมโทคอนเดรียของหนูเมาส์ แอนติไมซินกดการหายใจลง และสีย้อมเพิ่มการหายใจประมาณ 60 เปอร์เซ็นต์ จากราว 37 เป็น 59 nmol per minute per mg ไมโซไทอะซอลกดการหายใจลง 88 เปอร์เซ็นต์ เหลือประมาณ 4.5 และสีย้อมเพิ่มขึ้นห้าเท่าเป็นประมาณ 23 ศักย์เยื่อหุ้มกลับมาบางส่วนภายใต้สารยับยั้งทั้งสองชนิด โดยวัดด้วยสีย้อมสองชนิด (ซาฟรานิน O และ TMRM แบบวัดอัตราส่วน) เพื่อตัดความเป็นไปได้ของสัญญาณลวงทางแสง

งานนี้ยังทดสอบการส่งต่ออิเล็กตรอนโดยตรง ซึ่งการศึกษาแรกไม่ได้ทำ ไซโตโครม c ที่ผ่านการเติมหมู่อะเซทิลและเติมจากภายนอกที่ความเข้มข้น 25 micromolar ไม่ถูกรีดิวซ์โดยไมโทคอนเดรียที่มีพลังงาน ไม่ว่าจะมีสารยับยั้งหรือไม่ แต่การเติมสีย้อมทำให้เกิดการรีดิวซ์ในทั้งสองกรณี ในบัฟเฟอร์ที่ไม่มีเซลล์ NADH ร่วมกับสีย้อมรีดิวซ์ไซโตโครม c ด้วยอัตราที่แปรผันตาม NADH สรุปเส้นทางที่ข้ามได้ไกลกว่า คือ สมมูลรีดิวซ์ส่งไปยังสีย้อม สีย้อมส่งตรงไปยังไซโตโครม c แล้วผ่านคอมเพล็กซ์ IV ไปยังออกซิเจน เส้นทางนี้ข้ามคอมเพล็กซ์ III ไปทั้งหมด จึงข้ามการยับยั้งด้วยสารทั้งสองชนิดได้

ตัวชี้วัดเพิ่มเติมสองอย่างสนับสนุนการตีความนี้ สัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ของ NAD(P)H ลดลงเมื่อเติมสีย้อมลงในไมโทคอนเดรียที่ได้รับไมโซไทอะซอล แสดงว่าสมมูลรีดิวซ์ถูกระบายออกผ่านเส้นทางใหม่ นอกจากนี้ ค่าการดูดกลืนแสงของสีย้อมที่ 660 nm เปลี่ยนตามการเติมสารแต่ละครั้ง ขณะที่ส่วนใสหลังปั่นเหวี่ยงแสดงว่าสีย้อมในรูปออกซิไดซ์สะสมภายในไมโทคอนเดรียที่มีพลังงานสูงกว่าภายนอกกว่าร้อยเท่า แล้วออกมาเมื่อศักย์เยื่อหุ้มหมดลง การคำนวณจำนวนโปรตอนก็สอดคล้องกัน การข้ามขั้นตอนสูบโปรตอนทำให้เหลือประมาณ 2 โปรตอนต่ออิเล็กตรอนหนึ่งคู่ แทนที่จะเป็น 10 ดังนั้น การใช้ออกซิเจนเร็วขึ้นแต่ศักย์เยื่อหุ้มกลับมาเพียงบางส่วนจึงเป็นลักษณะที่คาดว่าจะพบจากการข้ามจริง ไม่ใช่หลักฐานคัดค้าน

ไมโทคอนเดรียที่เตรียมด้วยวิธีเดียวกันนี้ให้การตอบสนองที่อาจทำให้ผู้อ่านแบบผ่าน ๆ เข้าใจผิด เมื่อมีสารยับยั้งร่วมกับสีย้อม ADP กลับลดการหายใจแทนที่จะเพิ่ม และการยับยั้งการขนส่งกลับกระตุ้นการหายใจแทนที่จะชะลอ ขณะที่ศักย์เยื่อหุ้มยังเปลี่ยนไปในทิศทางปกติ การดูการใช้ออกซิเจนเพียงอย่างเดียวจึงทำให้เข้าใจผิดได้ในระบบนี้

การศึกษาที่สาม: งานในตับที่ทดสอบคอมเพล็กซ์ I และ II ไม่ใช่ III

Lee และ Boelsterli ใช้ไมโทคอนเดรียจากตับหนูเมาส์และเซลล์ตับเพาะเลี้ยงที่ได้รับความเสียหายจากเอฟาวิเรนซ์ (คอมเพล็กซ์ I, IC50 ใกล้ 30 micromolar) และไฮดราซีน ซึ่งเป็นเมแทบอไลต์ของไอโซไนอาซิด (คอมเพล็กซ์ II, IC50 ใกล้ 30 micromolar) สีย้อมที่ประมาณ 30 micromolar ทำให้การออกซิเดชันของ NADH ศักย์เยื่อหุ้ม และ ATP ฟื้นกลับ พร้อมลดสารออกซิแดนต์และการตายแบบเนโครซิส บทความใน Redox Biology อธิบายด้วยแบบจำลองที่สีย้อมพาอิเล็กตรอนอ้อมคอมเพล็กซ์ I และ II ที่เสียหาย

ผลนี้เป็นบริบทของส่วนต้นทางที่มีข้อสรุปชัดเจนแล้ว และไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับคอมเพล็กซ์ III เพราะงานนี้ไม่ได้ยับยั้งที่ตำแหน่งนั้น จึงไม่สามารถยืนยันหรือหักล้างการศึกษาในสมองทั้งสองงานได้

ตารางเปรียบเทียบเงื่อนไข

สี่เหตุผลที่การศึกษาคอมเพล็กซ์ III ทั้งสองงานอาจถูกต้องภายใต้การทดลองของตนเอง

1. การใช้สารยับยั้งไม่ใช่เงื่อนไขเดียวกัน แอนติไมซินเพียงชนิดเดียวที่ 1 microgram per ml ต่างจากแอนติไมซินที่ 0.3 micromolar และการทดสอบแยกด้วยสารยับยั้งตำแหน่ง Qo เส้นทางของสีย้อมที่ป้อนอิเล็กตรอนเข้าสู่ตำแหน่ง Qo ล้มเหลวตรงจุดที่เส้นทางส่งตรงไปยังไซโตโครม c ทำได้สำเร็จ การทดสอบตำแหน่งเดียวไม่อาจใช้แทนทั้งสองตำแหน่งได้

2. ปริมาณสีย้อมและจังหวะเวลาต่างกัน ความเข้มข้นหลัก 1 เทียบกับ 2 micromolar ในสารที่หมุนเวียนระหว่างสถานะรีดอกซ์ ซึ่งการนำเข้าสู่ไมโทคอนเดรียและการรีดิวซ์ไซโตโครม c โดยตรงขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและเวลา ความต่างของปริมาณเพียงเล็กน้อยร่วมกับเวลาวัดที่ต่างกันอาจเผยให้เห็นคนละแขนงของเครือข่ายเดียวกัน

3. วิธีเตรียมไมโทคอนเดรียต่างกัน การแยกด้วยดิจิโทนินกับการแยกด้วยความชันความหนาแน่นของ Percoll คัดเลือกประชากรไมโทคอนเดรียที่ทับซ้อนกัน แต่ไม่เหมือนกันทั้งหมด ความเข้มข้นโปรตีนเท่ากันที่ 0.1 mg per ml จึงตัดตัวแปรนี้ออกได้ แต่ยังตัดความต่างของประชากรย่อยและความสมบูรณ์ออกไม่ได้ และความต่างด้านชนิดสัตว์ก็ไม่ใช่คำอธิบาย เพราะกลุ่มที่สองทำซ้ำแล้วพบลักษณะการตอบสนองเดียวกันในหนูเมาส์ด้วย

4. สภาวะของสารตั้งต้นกำหนดว่าสีย้อมทำอะไรได้บ้าง สารตั้งต้นสามชุดต่างจากคู่สารตั้งต้นที่เชื่อมโยงกับ NADH ปริมาณ NADH ที่มีให้ใช้และศักย์เยื่อหุ้มร่วมกันกำหนดว่าสีย้อมถูกรีดิวซ์เร็วเพียงใดและกระจายไปอยู่ที่ใด เส้นทางที่ต้องมีสีย้อมในรูปรีดิวซ์อยู่ใกล้ไซโตโครม c ในรูปออกซิไดซ์จึงขึ้นอยู่กับการเลือกสารตั้งต้นนี้

วิธีอ่านข้ออ้างเรื่องการข้ามในครั้งต่อไป

ถามว่าคอมเพล็กซ์ใดถูกยับยั้ง ใช้สารยับยั้งชนิดใด ที่ตำแหน่งใด และปริมาณเท่าไร ถามความเข้มข้นของสีย้อมและเวลาที่วัดผล ถามเนื้อเยื่อ ชนิดสัตว์ วิธีแยก ความเข้มข้นโปรตีน และสารตั้งต้น และถามว่าศักย์เยื่อหุ้ม การหายใจ สถานะรีดอกซ์ และการทดสอบการส่งต่ออิเล็กตรอนโดยตรงให้ผลสอดคล้องกันหรือไม่ เพราะในที่นี้ การใช้ออกซิเจนเพียงอย่างเดียวชี้ไปผิดทางมากกว่าหนึ่งครั้ง

ข้อสรุปในขอบเขตจำกัดนี้ยังคงใช้ได้ การข้ามคอมเพล็กซ์ I ด้วยสีย้อมเป็นสิ่งที่งานวิจัยเห็นตรงกัน ส่วนคอมเพล็กซ์ III นั้น ไมโทคอนเดรียของหนูเมาส์ที่ได้รับแอนติไมซิน 1 microgram per ml และสีย้อม 1 micromolar ไม่แสดงการข้ามที่ทำให้การทำงานฟื้นกลับ ขณะที่สัตว์สามชนิดที่ได้รับแอนติไมซิน 0.3 micromolar หรือไมโซไทอะซอล 1 micromolar และสีย้อม 2 micromolar แสดงการข้ามได้บางส่วน พร้อมการถ่ายโอนอิเล็กตรอนจากสีย้อมไปยังไซโตโครม c โดยตรง ข้อความเหล่านี้เป็นจริงร่วมกันได้ ข้อสรุปที่กว้างกว่านี้คือการอนุมานเกินขอบเขตข้อมูล

บทอ่านที่เกี่ยวข้องช่วยวางข้ออ้างที่ยังเป็นข้อถกเถียงไว้ภายในกรอบเคมีที่ไม่มีข้อโต้แย้ง ได้แก่ เมทิลีนบลูเคลื่อนย้ายอิเล็กตรอนอย่างไร สำหรับการส่งต่ออิเล็กตรอน การทดลองข้ามคอมเพล็กซ์ I สำหรับกรณีส่วนต้นทางที่มีข้อสรุปชัดเจนแล้ว การวัดศักย์เยื่อหุ้มและสัญญาณลวง สำหรับเหตุผลที่ต้องใช้สีย้อมสองชนิด และการจัดการสารที่หมุนเวียนระหว่างสถานะรีดอกซ์ในห้องปฏิบัติการ สำหรับข้อผิดพลาดจากปริมาณและจังหวะเวลา