เมทิลีนบลูกับภาวะเซลล์ชรา: อธิบายตัวชี้วัดในการทดลองไฟโบรบลาสต์

ความเข้าใจผิดที่พบบ่อยมักเป็นเช่นนี้ งานวิจัยรายงานว่าเมทิลีนบลูทำให้ไฟโบรบลาสต์ที่เพาะเลี้ยงเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าได้อีกมากกว่า 20 ครั้ง ผู้อ่านจึงสรุปว่าเมทิลีนบลูกำจัดเซลล์ชราหรือยืดอายุขัยมนุษย์ได้ในสัดส่วนใกล้เคียงกัน ข้ออนุมานนี้ดูเป็นธรรมชาติ แต่ก็ผิดอยู่สองจุดที่แยกจากกัน

ปัญหาพื้นฐานอยู่ที่แนวคิด ไม่ใช่ตัวเลข จำนวนครั้งที่ประชากรเซลล์เพิ่มเป็นสองเท่า ตัวบ่งชี้ภาวะเซลล์ชรา และการวัดเทโลเมียร์ ต่างตอบคำถามคนละข้อ ควรอ่านงานวิจัยเมทิลีนบลูในไฟโบรบลาสต์ว่าเป็นการศึกษาการชะลอการเข้าสู่ภาวะเซลล์ชราในเซลล์ชนิดหนึ่งที่เพาะเลี้ยงในจาน โดยมีผลการวัดไมโทคอนเดรียสนับสนุน ซึ่งต่างจากการเลือกกำจัดเซลล์ที่เข้าสู่ภาวะเซลล์ชราแล้ว และยังต่างจากความชราของสิ่งมีชีวิตทั้งตัว บริบทที่กว้างขึ้นของความแตกต่างนี้เป็นส่วนหนึ่งของเรื่องการขนส่งอิเล็กตรอนในไมโทคอนเดรียกำหนดพลังงานของเซลล์อย่างไร และวิธีตีความข้อกล่าวอ้างจากงานวิจัยเมทิลีนบลู

จำนวนครั้งที่ประชากรเซลล์เพิ่มเป็นสองเท่าบอกประวัติ ไม่ใช่ความอ่อนวัย

ผลสำคัญส่วนใหญ่มาจากเซลล์ IMR90 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ไฟโบรบลาสต์ปอดปกติของทารกในครรภ์มนุษย์ที่มีความสามารถในการแบ่งตัวจำกัด ในการศึกษาระยะแรกเกี่ยวกับเมทิลีนบลูกับอายุการแบ่งตัวของไฟโบรบลาสต์ IMR90 มีการถ่ายเลี้ยงเซลล์ตามกำหนดและบันทึกจำนวนครั้งสะสมที่ประชากรเซลล์เพิ่มเป็นสองเท่าจนเซลล์เพาะเลี้ยงหยุดแบ่งตัว การให้สารในระดับนาโนโมลาร์ โดยเน้นที่ 100 nM ทำให้เซลล์เพาะเลี้ยงสะสมการเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าได้อีกมากกว่า 20 ครั้งก่อนหยุดแบ่งตัว

การเพิ่มประชากรเซลล์เป็นสองเท่าเป็นหน่วยสำหรับบันทึกจำนวน โดยบอกว่าประชากรเซลล์เพิ่มเป็นประมาณสองเท่ามาแล้วกี่ครั้ง ไม่ได้บอกโดยตรงว่าเซลล์แต่ละเซลล์อยู่ในภาวะชรา พักตัว เปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์เฉพาะทาง หรือตายแล้ว เซลล์เพาะเลี้ยงอาจเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าได้มากครั้งขึ้นเพราะเซลล์ยังคงแบ่งตัวได้เป็นเวลานานขึ้น เพราะมีเซลล์น้อยลงที่หยุดแบ่งตัวก่อนเวลาเมื่อเผชิญความเครียด หรือเพราะสภาวะการเพาะเลี้ยงคัดเลือกกลุ่มย่อยที่เพิ่มจำนวนได้ การนับเพียงอย่างเดียวไม่สามารถแยกความเป็นไปได้เหล่านี้ออกจากกันได้

นี่คือเหตุผลที่ต้องใช้จำนวนครั้งที่เพิ่มเป็นสองเท่าร่วมกับตัวบ่งชี้ จำนวนครั้งบอกว่าการเพิ่มจำนวนดำเนินต่อไปนานเพียงใด ส่วนตัวบ่งชี้บอกว่าเซลล์ที่หยุดแบ่งตัวหรือยังอยู่รอดเข้าสู่สภาวะใด

คู่มือตัวชี้วัดผล: ตัวบ่งชี้แต่ละชนิดบอกอะไร

ภาวะเซลล์ชราในระบบเพาะเลี้ยงเป็นลักษณะปรากฏที่ประเมินจากการวัดหลายอย่างที่เป็นอิสระต่อกัน ไม่มีการย้อมสีหรือโปรตีนชนิดใดเพียงชนิดเดียวที่ยืนยันภาวะนี้ได้

การหยุดเพิ่มจำนวนร่วมกับการสูญเสียการสังเคราะห์ DNA ตรวจสอบการหยุดแบ่งตัวที่คงอยู่ได้จากการนำ BrdU หรือ EdU เข้าไปใช้ลดลง รูปร่างเซลล์แบน และการไม่กลับมาเพิ่มจำนวนหลังย้ายไปเพาะเลี้ยงใหม่ วิธีนี้ช่วยแยกการหยุดแบ่งตัวจากภาวะเซลล์ชราออกจากการพักตัวชั่วคราว

เบตา-กาแลกโตซิเดสที่สัมพันธ์กับภาวะเซลล์ชรา การย้อม SA-beta-gal ตรวจการทำงานของไลโซโซมที่ pH ใกล้ 6.0 ไฟโบรบลาสต์ที่ชรามักให้ผลย้อมเป็นบวกเมื่อมวลของไลโซโซมเพิ่มขึ้น ตัวบ่งชี้นี้ไม่จำเพาะ จึงต้องแปลผลร่วมกับการเพิ่มจำนวนและตัวบ่งชี้ระดับโมเลกุล

วิถี p16 และ p21 p16 ออกฤทธิ์ผ่าน CDK4 และ CDK6 รวมถึงวิถี RB ส่วน p21 มักถูกกระตุ้นผ่าน p53 ระดับที่เพิ่มขึ้นสนับสนุนการหยุดแบ่งตัว แต่โปรตีนทั้งสองไม่ได้พบเฉพาะในภาวะเซลล์ชรา

สภาวะการหลั่งสาร ลักษณะการหลั่งสารที่สัมพันธ์กับภาวะเซลล์ชรา หรือ SASP หมายถึงการเปลี่ยนแปลงการปล่อยไซโตไคน์ คีโมไคน์ ปัจจัยการเจริญเติบโต และโปรตีเอส การตรวจ RNA หรือโปรตีนของปัจจัย SASP อธิบายว่าเซลล์ส่งสัญญาณไปยังเซลล์ข้างเคียงอย่างไร ไม่ได้วัดความสามารถในการแบ่งตัวโดยตรง

สารออกซิแดนต์และค่าที่วัดจากไมโทคอนเดรีย งานวิจัยเมทิลีนบลูเพิ่มการวัดในระดับไมโทคอนเดรีย ได้แก่ ปริมาณและกิจกรรมของคอมเพล็กซ์ IV การใช้ออกซิเจน การสังเคราะห์ฮีม มวลเยื่อหุ้ม ศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้ม ATP และสัญญาณของสารออกซิแดนต์ การวัดเหล่านี้อธิบายสภาวะเมแทบอลิซึมที่เกิดร่วมกับการหยุดแบ่งตัวที่ล่าช้าออกไป แม้จะไม่สามารถนิยามภาวะเซลล์ชราได้ด้วยตัวเอง แต่ใช้ทดสอบกลไกที่เสนอไว้ได้ แบบจำลองวัฏจักรรีดอกซ์ ซึ่ง NAD(P)H รีดิวซ์เมทิลีนบลูและไซโตโครม c ออกซิไดซ์เมทิลีนบลูกลับอีกครั้ง อธิบายไว้ในการศึกษา IMR90 เดียวกันที่เชื่อมโยงวัฏจักรรีดอกซ์กับการผลิตสารออกซิแดนต์ที่ลดลง หลักการที่เกี่ยวข้องกับปริมาณสารและการกระจายตัวกล่าวถึงไว้ในหัวข้อเภสัชวิทยาของเมทิลีนบลูและการได้รับสารของเนื้อเยื่อ

อัตราการสั้นลงของเทโลเมียร์ หน่วยที่ถูกต้องคือจำนวนคู่เบสที่สูญเสียต่อการเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าตลอดช่วงหลายสัปดาห์ ไม่ใช่ความยาว ณ เวลาใดเวลาหนึ่ง การสั้นลงที่ช้าลงหมายถึงความยาวลดลงน้อยลงต่อการแบ่งตัว ไม่ได้หมายถึงการยาวขึ้น และความเครียดอาจทำให้เซลล์ IMR90 หยุดแบ่งตัวได้แม้เทโลเมียร์จะเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อย

เปรียบเทียบการออกแบบการศึกษาไฟโบรบลาสต์สามแบบ

เนื้อหาต้นฉบับที่จัดทำขึ้นสำหรับหน้านี้คือการเปรียบเทียบด้านล่าง ซึ่งแสดงชนิดเซลล์ การได้รับสาร การวัด และข้อจำกัดไว้ในมุมมองเดียว

การศึกษา	เซลล์และการได้รับสาร	สิ่งที่วัด	สิ่งที่แสดงไม่ได้
Atamna และคณะ, FASEB J 2008	ไฟโบรบลาสต์ IMR90 ปกติ ได้รับเมทิลีนบลูระดับนาโนโมลาร์อย่างต่อเนื่อง โดยใช้ 100 nM เป็นสภาวะมาตรฐาน	จำนวนครั้งสะสมที่ประชากรเพิ่มเป็นสองเท่า ปริมาณคอมเพล็กซ์ IV การใช้ออกซิเจนที่เพิ่มขึ้น 37 ถึง 70 เปอร์เซ็นต์ การสังเคราะห์ฮีม การบรรเทาภาวะเซลล์ชราก่อนวัยที่เหนี่ยวนำด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์หรือแคดเมียม เอนไซม์ระยะ 2 ในเซลล์ HepG2	ไม่มีการทดสอบการกำจัดเซลล์ชรา ไม่มีตัวชี้วัดผลด้านอายุขัยในสัตว์หรือมนุษย์ อายุการแบ่งตัวในที่นี้หมายถึงจำนวนครั้งที่ประชากรเพิ่มเป็นสองเท่าในจานเพาะเลี้ยง
Atamna และคณะ, Redox Biology 2015 อธิบายไว้ในการศึกษาต่อยอดด้านกลไกของ AMPK และการสร้างคอมเพล็กซ์ IV	ไฟโบรบลาสต์ IMR90 ได้รับเมทิลีนบลูส่วนใหญ่ที่ 100 nM โดยมี AICAR เป็นสารกระตุ้น AMPK แบบต่อเนื่องสำหรับเปรียบเทียบ	การเปลี่ยนแปลงตามเวลาของอัตราส่วน NAD ต่อ NADH การเติมหมู่ฟอสเฟตให้ AMPK แบบชั่วคราว การเหนี่ยวนำ PGC-1alpha และ SURF1 กิจกรรมของคอมเพล็กซ์ IV ที่เพิ่มขึ้นมากกว่า 100 เปอร์เซ็นต์ สารออกซิแดนต์ลดลง 28 เปอร์เซ็นต์ เทโลเมียร์สั้นลงช้าลง การเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าเพิ่มอีกประมาณ 18 ครั้ง เทียบกับประมาณ 2 ครั้งเมื่อใช้ AICAR ไม่มีผลต่อวัฏจักรเซลล์	การเปรียบเทียบกับ AICAR ใช้ปริมาณสารต่างกันประมาณ 1000 เท่าและมีความจำเพาะต่างกัน จึงทดสอบรูปแบบการกระตุ้น ไม่ใช่ความแรงที่เทียบเคียงกัน ผลด้านเทโลเมียร์ใช้กับเซลล์เพาะเลี้ยงที่กำลังแบ่งตัวตลอดช่วงหลายสัปดาห์
Xiong และคณะ, Aging Cell 2016 รายงานไว้ในการศึกษาไฟโบรบลาสต์จากโรคโพรจีเรียเกี่ยวกับการฟื้นสภาพไมโทคอนเดรียและนิวเคลียส	ไฟโบรบลาสต์ผิวหนังปฐมภูมิจากผู้เป็นโรคโพรจีเรียชนิด Hutchinson-Gilford พร้อมเซลล์ควบคุมปกติที่จับคู่กัน ส่วนใหญ่ใช้ 100 nM เป็นเวลา 5 ถึง 12 สัปดาห์	รูปร่างไมโทคอนเดรียจากกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน การเคลื่อนที่จากการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิต ซูเปอร์ออกไซด์ ศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้ม ATP PGC-1alpha การเพิ่มจำนวนและตัวบ่งชี้ภาวะเซลล์ชรา รวมถึงการโป่งของนิวเคลียส ตำแหน่งของโพรเจอริน เฮเทอโรโครมาติน และการแสดงออกของยีน	เป็นแบบจำลองความชราก่อนวัยที่จำเพาะต่อโรค ไม่ใช่ความชราตามปกติ การฟื้นสภาพรูปร่างและตัวบ่งชี้ไม่ใช่การกำจัดเซลล์ชรา ไม่มีตัวชี้วัดผลด้านประสิทธิผลในสัตว์หรือทางคลินิก
บทความทบทวนโดย Xue และคณะ, Cells 2021 สรุปไว้ในบทความทบทวนเมทิลีนบลูในฐานะสารที่อาจมีบทบาทต้านความชรา	สังเคราะห์วรรณกรรมเกี่ยวกับความชราของสมอง การเสื่อมของระบบประสาท ผิวหนัง การสมานแผล และโรคโพรจีเรีย	อธิบายเมทิลีนบลูในฐานะสารที่หมุนเวียนในวัฏจักรรีดอกซ์เชิงเร่งปฏิกิริยา ซึ่งสามารถข้ามบางส่วนของเส้นทางการขนส่งในคอมเพล็กซ์ I และ III โดยพิจารณาร่วมกับทฤษฎีความชราจากอนุมูลอิสระ	เป็นเพียงการสังเคราะห์เชิงบรรยาย จัดระบบสมมติฐานและระบุจุดที่หลักฐานทางคลินิกยังไม่ชัดเจน

รูปแบบที่พบร่วมกันระหว่างแถวสำคัญกว่าแถวใดแถวหนึ่ง เมทิลีนบลูในปริมาณต่ำมีความสัมพันธ์ซ้ำ ๆ กับช่วงเวลาที่เซลล์เพิ่มจำนวนได้นานขึ้น กิจกรรมของคอมเพล็กซ์ IV ที่สูงขึ้น สัญญาณสารออกซิแดนต์ที่ลดลง และรูปร่างที่ดีขึ้น การออกแบบยังคงเป็นการติดตามตามเวลา คือเริ่มจากเซลล์ที่กำลังแบ่งตัว ให้สารระหว่างการเพิ่มจำนวน และบันทึกว่าการแบ่งตัวดำเนินต่อไปได้นานเพียงใด โครงสร้างนี้สนับสนุนข้อกล่าวอ้างเรื่องการชะลอได้ แต่ไม่สามารถสนับสนุนข้อกล่าวอ้างเรื่องการกำจัดหากไม่มีการออกแบบที่ต่างออกไป

การชะลอภาวะเซลล์ชราไม่ใช่การกำจัดเซลล์ชรา

การชะลอหมายถึงเซลล์ที่กำลังแบ่งตัวสามารถแบ่งตัวต่อไปได้นานขึ้นก่อนหยุด ส่วนการกำจัด ซึ่งมักเรียกว่าฤทธิ์เซโนไลติก หมายถึงการเลือกฆ่าหรือลดจำนวนเซลล์ที่ชราแล้ว ขณะที่เซลล์ข้างเคียงซึ่งกำลังเพิ่มจำนวนยังอยู่รอด

วรรณกรรมเมทิลีนบลูในไฟโบรบลาสต์ทดสอบโครงสร้างแบบแรก เซลล์เพาะเลี้ยงเริ่มต้นในสภาวะที่เพิ่มจำนวนได้ ได้รับสารระหว่างการถ่ายเลี้ยงต่อเนื่อง และเข้าสู่การหยุดแบ่งตัวช้าลง ตัวบ่งชี้อย่าง SA-beta-gal, p16, p21 และปัจจัย SASP จึงปรากฏช้าลงหรือมีระดับต่ำลงเมื่อเทียบ ณ รอบการถ่ายเลี้ยงเดียวกัน รูปแบบนี้เป็นสิ่งที่คาดได้เมื่อเวลาเริ่มเข้าสู่ภาวะเซลล์ชราเลื่อนออกไป ไม่ได้พิสูจน์ว่าเซลล์ใดที่เข้าสู่ภาวะเซลล์ชราแล้วถูกกำจัด

ข้อกล่าวอ้างเรื่องฤทธิ์เซโนไลติกต้องใช้การจัดการทดลองที่ต่างออกไป คือทำให้เซลล์เพาะเลี้ยงเข้าสู่ภาวะเซลล์ชราที่ตรวจยืนยันแล้วก่อน จากนั้นให้สาร แล้วแสดงให้เห็นการสูญเสียเซลล์ชราแบบเลือกจำเพาะเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุมที่กำลังเพิ่มจำนวน โดยวัดความมีชีวิตและการตายโดยตรง การลดลงของตัวบ่งชี้เพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอ เพราะการแสดงออกอาจเปลี่ยนไปโดยไม่มีการสูญเสียเซลล์ และเซลล์ที่ยังเพิ่มจำนวนได้อาจเจริญจนเต็มจาน ไม่มีแหล่งข้อมูลใดในสี่แหล่งที่อ้างถึงใช้การออกแบบเพื่อตรวจการลดจำนวนเซลล์แบบเลือกจำเพาะนี้กับเมทิลีนบลู ดังนั้นคำเรียกที่ถูกต้องยังคงเป็นฤทธิ์ชะลอภาวะเซลล์ชราหรือต้านภาวะเซลล์ชราในหลอดทดลอง ไม่ใช่ฤทธิ์เซโนไลติก ด้านความเครียดออกซิเดชันของความแตกต่างนี้อธิบายเพิ่มเติมไว้ในเซลล์ควบคุมชนิดออกซิเจนที่ไวต่อปฏิกิริยาอย่างไร

ผลด้านการส่งสัญญาณแบบชั่วคราวทำให้ประเด็นนี้ชัดเจนขึ้น ในงาน IMR90 ปี 2015 เมทิลีนบลูทำให้อัตราส่วน NAD ต่อ NADH เพิ่มขึ้นช่วงสั้น ๆ และเกิดการเติมหมู่ฟอสเฟตให้ AMPK ช่วงสั้น ๆ ตามด้วยการเหนี่ยวนำ PGC-1alpha และ SURF1 ซึ่งทั้งคู่เชื่อมโยงกับการสร้างคอมเพล็กซ์ IV การกระตุ้น AMPK อย่างต่อเนื่องด้วย AICAR ให้ผลด้อยกว่ามากในด้านจำนวนครั้งที่เพิ่มประชากรเป็นสองเท่าได้เพิ่มเติม

อายุการแบ่งตัวไม่ใช่อายุขัยมนุษย์

อายุการแบ่งตัวของเซลล์นับจำนวนครั้งที่ประชากรเพิ่มเป็นสองเท่าก่อนหยุดแบ่งตัวในจานเพาะเลี้ยงที่ควบคุมออกซิเจน อาหารเลี้ยงเซลล์ และจังหวะการถ่ายเลี้ยงให้คงที่ อายุขัยมนุษย์รวมกระบวนการหลายสิบปีของพัฒนาการ ภูมิคุ้มกัน ระบบหลอดเลือด สภาพแวดล้อมเฉพาะของเซลล์ต้นกำเนิด พฤติกรรม และโรค สารชนิดหนึ่งอาจยืดอายุการแบ่งตัวโดยไม่เปลี่ยนอายุขัยมนุษย์ และสารส่วนใหญ่ก็เป็นเช่นนั้น

ไฟโบรบลาสต์จากโรคโพรจีเรียมีการกลายพันธุ์ของ LMNA ที่ระบุได้ชัดเจนและทำให้เกิดโพรเจอริน โดยมีไมโทคอนเดรียที่แตกเป็นส่วนและเคลื่อนที่ได้น้อยลง ATP ต่ำ นิวเคลียสรูปร่างผิดปกติ และการสูญเสียเฮเทอโรโครมาติน เมทิลีนบลูระดับนาโนโมลาร์ทำให้ค่าการวัดไมโทคอนเดรียดีขึ้นและฟื้นค่าการวัดนิวเคลียสได้อย่างมาก รวมถึงการปลดโพรเจอรินออกจากเยื่อหุ้ม นี่เป็นการฟื้นสภาพในระดับเซลล์ที่เด่นชัด แต่ยังคงเป็นผลในไฟโบรบลาสต์ และผู้เขียนระบุการทดสอบในสัตว์ไว้เป็นงานในอนาคต ตัวแบบจำลองโรคนี้กล่าวถึงเพิ่มเติมในเมทิลีนบลูในแบบจำลองโรคโพรจีเรียและความชราก่อนวัย

จากประเด็นเหล่านี้ สามารถใช้รายการตรวจสอบในการอ่านได้ดังนี้

ถามว่าการให้สารเริ่มก่อนเซลล์หยุดแบ่งตัว หรือหลังจากยืนยันการหยุดแบ่งตัวแล้ว การให้ก่อนสนับสนุนการชะลอ ส่วนการกำจัดต้องมีการให้หลังจากนั้นร่วมกับข้อมูลการตายแบบเลือกจำเพาะ
ถามว่าเส้นโค้งการเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าของกลุ่มควบคุมเป็นอย่างไร หากไม่มีจำนวนครั้งสะสมที่เพิ่มเป็นสองเท่า การเปลี่ยนแปลงของตัวบ่งชี้ก็ขาดบริบท
ขอข้อมูลตัวบ่งชี้อย่างน้อยสองกลุ่ม เช่น การติดฉลากเพื่อวัดการเพิ่มจำนวนร่วมกับ p16 หรือ p21 และ SA-beta-gal แทนการใช้ผลย้อมสีเพียงอย่างเดียว
ถามว่ารายงานเทโลเมียร์อย่างไร อัตราต่อการเพิ่มประชากรเป็นสองเท่าที่ติดตามตามเวลามีความหมาย ส่วนความยาวที่วัดเพียงครั้งเดียวไม่มี
ถามว่าควบคุมอะไรให้คงที่บ้าง ความหนาแน่นของเซลล์ขณะถ่ายเลี้ยง ออกซิเจน การเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ และสารละลายตั้งต้นเมทิลีนบลูที่เตรียมใหม่เทียบกับที่เก็บไว้นาน ล้วนเปลี่ยนการหยุดแบ่งตัวของไฟโบรบลาสต์ได้

เมื่ออ่านในลักษณะนี้ วรรณกรรมไฟโบรบลาสต์ให้บทบาทแก่เมทิลีนบลูที่สอดคล้องกันแต่มีขอบเขตจำกัด นั่นคือสารที่ออกฤทธิ์รีดอกซ์ในปริมาณต่ำซึ่งชะลอภาวะเซลล์ชราจากการแบ่งตัวในไฟโบรบลาสต์มนุษย์ที่เพาะเลี้ยง พร้อมกับทำให้ค่าการวัดไมโทคอนเดรียดีขึ้น โดยมีรายละเอียดด้านกลไกที่หนักแน่นที่สุดเกี่ยวกับการส่งสัญญาณพลังงานแบบชั่วคราวและการสร้างคอมเพล็กซ์ IV และงานเหล่านี้ไม่มีการแสดงให้เห็นการกำจัดเซลล์ชราหรือการยืดอายุขัยมนุษย์