మిథిలీన్ బ్లూ మైటోకాండ్రియల్ కాంప్లెక్స్ IIIని దాటగలదా? అధ్యయనాలు ఎందుకు విభేదిస్తున్నాయి

నిరోధించిన మైటోకాండ్రియల్ కాంప్లెక్స్ IIIని మిథిలీన్ బ్లూ దాటగలదా అని రెండు ప్రయోగశాలలు పరిశీలించాయి. ఒకటి లేదని సమాధానమిచ్చింది. మరొకటి అవునని సమాధానమిచ్చింది. రెండింటికీ ఆధారంగా డేటా ఉంది.

ఎలుక మెదడు మైటోకాండ్రియాలో చేసిన మొదటి అధ్యయనం, ఈ రంగు పదార్థం అలా చేయలేదని తేల్చింది. మూడు రోడెంట్ జాతుల మెదడు మైటోకాండ్రియాలో చేసిన రెండో అధ్యయనం, అది కొంతవరకు చేయగలదని తేల్చింది. ఎలుక కాలేయంలో చేసిన మూడో అధ్యయనాన్ని తరచూ వీటితో కలిపి ప్రస్తావిస్తారు, కానీ అది వేరే విషయాన్ని పరీక్షించింది. దాన్ని సరైన సందర్భంలో ఉంచితే సగం గందరగోళం తొలగిపోతుంది.

అన్ని సందర్భాలకూ వర్తించే ఒకే యాంత్రిక విధానాన్ని ప్రకటించలేం. వేర్వేరు నిరోధకాలు, మోతాదులు, కొలతలతో చేసిన మూడు ప్రయోగాలు ఉన్నాయి. ముందుగా పరిస్థితులను చదవండి. వాటి నుంచే నిర్ధారణలు వస్తాయి.

ఇక్కడ బైపాస్ అంటే ఏమిటి

ఎలక్ట్రాన్లు కాంప్లెక్స్ I ద్వారా (NADH నుంచి) లేదా కాంప్లెక్స్ II ద్వారా (సక్సినేట్ నుంచి) గొలుసులోకి ప్రవేశించి, కాంప్లెక్స్ III ద్వారా సైటోక్రోమ్ cకి చేరి, తర్వాత కాంప్లెక్స్ IV ద్వారా ఆక్సిజన్‌కు చేరతాయి. ఈ క్రమంలో ఏర్పడే ప్రవణతను కణం ATP తయారీకి వినియోగిస్తుంది.

బైపాస్ వాదన ప్రకారం, మిథిలీన్ బ్లూ నిరోధానికి ముందు భాగంలో ఎలక్ట్రాన్లను తీసుకుని, దాని తర్వాత భాగంలో అందిస్తుంది. ఆక్సీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం NADH లేదా గొలుసు ప్రారంభ భాగాల నుంచి ఎలక్ట్రాన్లను తీసుకుని ల్యూకోమిథిలీన్ బ్లూగా మారుతుంది. ఆ క్షయీకరణ రూపం వాటిని సైటోక్రోమ్ cకి లేదా తిరిగి గొలుసులోకి అందిస్తుంది. ఈ బదిలీ నిరోధం తర్వాతి భాగానికి జరిగితే, శ్వాసక్రియ మరియు పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ కొంతవరకు కోలుకుంటాయి. నిరోధం ఉన్న చోటికే లేదా దానికి ముందరి భాగానికే జరిగితే, ఏదీ కోలుకోదు.

కాంప్లెక్స్ IIIకి సంబంధించిన ఒక వివరమే ఈ వివాదంలో చాలా భాగాన్ని నిర్ణయిస్తుంది. ఈ కాంప్లెక్స్ రెండు నిరోధక స్థానాలతో కూడిన Q చక్రాన్ని నడుపుతుంది. యాంటిమైసిన్ Qi స్థానానికి బంధిస్తుంది. మిక్సోథయాజోల్ Qo స్థానానికి బంధిస్తుంది. వీటిలో ఒక్కదానినే ఉపయోగించిన అధ్యయనం కాంప్లెక్స్‌లో సగాన్ని మాత్రమే పరీక్షించినట్లు.

మొదటి అధ్యయనం: ఎలుక మెదడు మైటోకాండ్రియాలో బైపాస్ లేదు

గురీవ్ మరియు సహచరులు C57BL/6 ఎలుకల మెదడు కార్టెక్స్ మైటోకాండ్రియాను ఉపయోగించారు. వాటిని డిజిటోనిన్‌తో వేరుచేసి, mlకు 0.1 mg ప్రోటీన్ సాంద్రత వద్ద పరీక్షించారు. సబ్‌స్ట్రేట్‌లను మూడు విధాలుగా ఉపయోగించారు: పైరువేట్, మాలేట్ ఒక్కొక్కటి 5 mM; సక్సినేట్ 10 mMతో పాటు గ్లూటామేట్ 2 mM; L-ప్రోలిన్ 10 mM. నిరోధకాలుగా రోటెనోన్ 1 micromolar (కాంప్లెక్స్ I), యాంటిమైసిన్ mlకు 1 microgram (కాంప్లెక్స్ III) వాడారు. రంగు పదార్థం మోతాదులు 0.5, 1, 2 micromolar; ప్రధాన సాంద్రత 1 micromolar. పద్ధతులు, కొలతల ట్రేస్‌లు FEBS Letters పరిశోధన నివేదికలో ఉన్నాయి.

కాంప్లెక్స్ I బైపాస్ పనిచేసింది. రోటెనోన్, ADP ప్రేరేపిత శ్వాసక్రియను నిమిషానికి mgకు సుమారు 121 నుంచి సుమారు 2 nmolకు తగ్గించింది; 1 micromolar రంగు పదార్థం దాన్ని సుమారు 21కి పునరుద్ధరించింది. పైరువేట్‌తో పాటు మాలేట్ వాడినప్పుడు, అలాగే L-ప్రోలిన్ వాడినప్పుడు పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ కోలుకుంది.

కాంప్లెక్స్ III బైపాస్ పనిచేయలేదు. యాంటిమైసిన్ శ్వాసక్రియను సుమారు 16కి తగ్గించింది; రంగు పదార్థం దాన్ని సుమారు 20కి మాత్రమే పెంచింది. రంగు పదార్థం మోతాదును 5 micromolar వరకు పెంచినా, ఏ సబ్‌స్ట్రేట్‌పైనా పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ కోలుకోలేదు. పెరాక్సైడ్ డేటా కూడా ఇదే సూచించింది: రంగు పదార్థం ఒక్కటే ఉన్నప్పుడు, నిమిషానికి mgకు దాదాపు 76 pmol ఉన్న ప్రాథమిక పెరాక్సైడ్ విడుదల రేటు, ఆ మూడు మోతాదుల వద్ద సుమారు 1170, 1460, 1945కి పెరిగింది. అయితే రంగు పదార్థం వల్ల ఏర్పడిన ఆ సంకేతాన్ని యాంటిమైసిన్ వరుసగా సుమారు 25, 88, 96 శాతం తగ్గించింది. క్షయీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం నేరుగా ఆక్సిజన్‌తో ప్రతిచర్య జరిపితే, కాంప్లెక్స్ IIIని నిరోధించడం ఆ సంకేతాన్ని అణచకూడదు. క్షయీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం, యాంటిమైసిన్ నిరోధానికి ముందున్న కాంప్లెక్స్ IIIలోని Qo స్థానం వద్ద ఆక్సీకరణ చెందుతుందని రచయితలు ఊహించారు. ఈ చిన్న చక్రాన్ని మాటల్లో చెప్పాలంటే: దాతల నుంచి రంగు పదార్థానికి, రంగు పదార్థం నుంచి Qoకి, అక్కడి నుంచి సాధారణ మార్గంలో ముందుకు. రోటెనోన్‌ను దాటుతుంది. యాంటిమైసిన్‌ను దాటదు.

రెండో అధ్యయనం: మూడు జాతుల్లో, రెండు నిరోధక స్థానాల వద్ద పాక్షిక బైపాస్

స్వాబ్ మరియు సహచరులు ప్రయోగ రూపకల్పనను విస్తరించారు. ఎలుకలు, పెద్ద ఎలుకలు, గినియా పిగ్‌ల మెదడు మైటోకాండ్రియాను పెర్కాల్‌తో వేరుచేసి, అదే mlకు 0.1 mg సాంద్రత వద్ద పరీక్షించారు. పైరువేట్‌తో పాటు మాలేట్ లేదా గ్లూటామేట్‌తో పాటు మాలేట్‌ను ఒక్కొక్కటి 5 mM వద్ద ఉపయోగించారు. వారు రెండు కాంప్లెక్స్ III నిరోధకాలను వాడారు: యాంటిమైసిన్ A 0.3 micromolar, మిక్సోథయాజోల్ 1 micromolar. చాలా పరీక్షల్లో రంగు పదార్థం 2 micromolar; సైటోక్రోమ్ c పరిశీలనల్లో 0.5. ఒకే విధమైన విధానాలతో పరీక్షించిన మూడు జాతుల వివరాలన్నీ ఉచితంగా అందుబాటులో ఉన్న పరిశోధనా పత్రంలో ఉన్నాయి.

మూడు జాతుల్లోనూ రెండు నిరోధాలను కొంతవరకు దాటగలిగింది. ఎలుక మైటోకాండ్రియాలో యాంటిమైసిన్ శ్వాసక్రియను అణచింది; రంగు పదార్థం దాన్ని సుమారు 60 శాతం పెంచింది—నిమిషానికి mgకు దాదాపు 37 నుంచి 59 nmolకు. మిక్సోథయాజోల్ దాన్ని 88 శాతం అణచి, సుమారు 4.5కి తగ్గించింది; రంగు పదార్థం దాన్ని ఐదు రెట్లు పెంచి సుమారు 23కి తీసుకెళ్లింది. ఏ నిరోధకం ఉన్నా పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ కొంతవరకు తిరిగి ధ్రువీకరణ చెందింది. ఆప్టికల్ కొలతల వల్ల కలిగే తప్పుడు ప్రభావాలను మినహాయించేందుకు రెండు రంగు పదార్థాలతో (సాఫ్రనిన్ O, రేషియోమెట్రిక్ TMRM) దీన్ని కొలిచారు.

మొదటి అధ్యయనం చేయని విధంగా, ఈ పత్రం ఎలక్ట్రాన్ బదిలీని నేరుగా కూడా పరీక్షించింది. బయట నుంచి చేర్చిన అసిటైలేటెడ్ సైటోక్రోమ్ c, 25 micromolar వద్ద, నిరోధకాలు ఉన్నా లేకపోయినా శక్తీకృత మైటోకాండ్రియా ద్వారా క్షయీకరణ చెందలేదు. కానీ రంగు పదార్థాన్ని చేర్చడం రెండు సందర్భాల్లోనూ క్షయీకరణను నడిపించింది. కణాలు లేని బఫర్‌లో NADHతో పాటు రంగు పదార్థం, NADHకి అనుపాతమైన రేటులో సైటోక్రోమ్ cని క్షయీకరణ చేసింది. ఈ సుదీర్ఘ దాటవేతను మాటల్లో చెప్పాలంటే: క్షయీకరణ సమానకాల నుంచి రంగు పదార్థానికి, రంగు పదార్థం నుంచి నేరుగా సైటోక్రోమ్ cకి, కాంప్లెక్స్ IV ద్వారా ఆక్సిజన్‌కు. ఈ మార్గం కాంప్లెక్స్ IIIని పూర్తిగా దాటేస్తుంది, కాబట్టి రెండు నిరోధకాలనూ దాటడం సాధ్యమే.

మరో రెండు కొలతలు ఈ వివరణకు మద్దతిస్తాయి. మిక్సోథయాజోల్‌తో చికిత్స చేసిన మైటోకాండ్రియాకు రంగు పదార్థం చేర్చినప్పుడు NAD(P)H ఫ్లోరెసెన్స్ తగ్గింది. అంటే కొత్త మార్గం ద్వారా క్షయీకరణ సమానకాలు వినియోగించబడ్డాయి. అలాగే 660 nm వద్ద రంగు పదార్థపు కాంతి శోషణ, వరుసగా చేసిన ప్రతి చేర్పును ప్రతిబింబించింది. సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసిన తర్వాతి సూపర్‌నేటెంట్‌ల పరిశీలనలో, శక్తీకృత మైటోకాండ్రియా లోపల ఆక్సీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం వంద రెట్లకు పైగా పేరుకుందని, పొటెన్షియల్ కూలిపోయినప్పుడు బయటకు వెళ్లిందని కనిపించింది. ప్రోటాన్‌ల లెక్క కూడా సరిపోతుంది: పంపింగ్ దశలను దాటేయడం వల్ల ప్రతి ఎలక్ట్రాన్ జతకు 10 బదులుగా సుమారు 2 ప్రోటాన్‌లు మిగులుతాయి. అందువల్ల ఆక్సిజన్ వినియోగం వేగంగా జరిగినా పాక్షిక పునర్ధ్రువీకరణ మాత్రమే కనిపించడం నిజమైన బైపాస్‌కు సరిపోయే లక్షణం; అది బైపాస్‌కు వ్యతిరేక ఆధారం కాదు.

ఇదే సన్నాహం ఇచ్చిన కొన్ని ప్రతిస్పందనలు ఉపరితలంగా చదివితే తప్పుదారి పట్టిస్తాయి. నిరోధకంతో పాటు రంగు పదార్థం ఉన్నప్పుడు, ADP శ్వాసక్రియను పెంచడానికి బదులుగా తగ్గించింది; రవాణాను నిరోధించడం దాన్ని మందగించడానికి బదులుగా ప్రేరేపించింది. అయినా పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ సాధారణ దిశల్లోనే మారింది. ఈ వ్యవస్థలో ఆక్సిజన్ వినియోగం ఒక్కటినే చూస్తే తప్పుదారి పడతాం.

మూడో అధ్యయనం: కాంప్లెక్స్‌లు I, IIని పరీక్షించిన కాలేయ అధ్యయనం, IIIని కాదు

లీ మరియు బోల్స్టెర్లీ ఎలుక కాలేయ మైటోకాండ్రియాను, ప్రయోగశాలలో పెంచిన హెపటోసైట్‌లను ఉపయోగించారు. ఎఫావిరెంజ్ (కాంప్లెక్స్ I, IC50 దాదాపు 30 micromolar), ఐసోనియాజిడ్ మెటబోలైట్ అయిన హైడ్రజీన్ (కాంప్లెక్స్ II, IC50 దాదాపు 30 micromolar) వల్ల వాటికి నష్టం కలిగించారు. సుమారు 30 micromolar వద్ద రంగు పదార్థం NADH ఆక్సీకరణను, పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్‌ను, ATPని పునరుద్ధరించింది; అదే సమయంలో ఆక్సీకారకాలను, నెక్రోటిక్ కణ మరణాన్ని తగ్గించింది. దెబ్బతిన్న కాంప్లెక్స్‌లు I, IIని దాటి రంగు పదార్థం ఎలక్ట్రాన్లను మోసుకెళ్తున్నట్లు Redox Biology పరిశోధనా పత్రం నమూనా వివరణ ఇస్తుంది.

ఆ ఫలితం గొలుసు ముందరి భాగానికి సంబంధించిన, ఏకాభిప్రాయం ఉన్న నేపథ్యం. అది కాంప్లెక్స్ III గురించి ఏమీ చెప్పదు, ఎందుకంటే ఆ అధ్యయనంలో అక్కడ ఏదీ నిరోధించలేదు. అది రెండు మెదడు అధ్యయనాల్లో దేనినీ ధృవీకరించలేదు, ఖండించలేదు.

పరిస్థితుల పోలిక పట్టిక

రెండు కాంప్లెక్స్ III అధ్యయనాలూ తమ సొంత ప్రయోగ పరిస్థితుల్లో సరైనవి కావడానికి నాలుగు కారణాలు

1. నిరోధకం ద్వారా చేసిన జోక్యం ఒకటే కాదు. ఒకవైపు యాంటిమైసిన్ ఒక్కటే mlకు 1 microgram; మరోవైపు యాంటిమైసిన్ 0.3 micromolarతో పాటు విడిగా Qo స్థానం నిరోధకం. Qo స్థానానికి ఎలక్ట్రాన్లను అందించే రంగు పదార్థపు మార్గం విఫలమయ్యే చోటే, నేరుగా సైటోక్రోమ్ cకి అందించే మార్గం విజయవంతమవుతుంది. ఒక స్థానాన్ని పరీక్షించడం రెండింటినీ పరీక్షించినట్లు కాదు.

2. రంగు పదార్థం మోతాదు, సమయం వేర్వేరు. ప్రధాన సాంద్రతలు 1, 2 micromolar. ఈ రెడాక్స్ చక్ర పదార్థం లోపలికి చేరడం, సైటోక్రోమ్ cని నేరుగా క్షయీకరణ చేయడం సాంద్రత, సమయంపై ఆధారపడతాయి. చిన్న మోతాదు వ్యత్యాసాలతో పాటు కొలతల సమయం మారడం, ఒకే నెట్‌వర్క్‌లోని వేర్వేరు భాగాలను బయటపెట్టవచ్చు.

3. మైటోకాండ్రియా సన్నాహాలు వేర్వేరు. డిజిటోనిన్‌తో వేరుచేయడం, పెర్కాల్ ప్రవణతతో వేరుచేయడం కొంతవరకు ఒకదానితో మరొకటి సరిపోలే, కానీ పూర్తిగా ఒకేలా కాని మైటోకాండ్రియా సమూహాలను ఎంపిక చేస్తాయి. ప్రోటీన్ సాంద్రత రెండింటిలోనూ mlకు 0.1 mg కాబట్టి, ఆ చరరాశి కారణం కాదు. కానీ ఉపసమూహాలు, వాటి నిర్మాణ సమగ్రత విషయంలో అలా చెప్పలేం. జాతి వ్యత్యాసమే కారణమనే అనుమానం కూడా తొలగింది: రెండో బృందం అదే ప్రతిస్పందనను ఎలుకలోనూ పునరుత్పత్తి చేసింది.

4. సబ్‌స్ట్రేట్ స్థితి రంగు పదార్థం ఏమి చేయగలదో నిర్ణయిస్తుంది. ఒకవైపు మూడు సబ్‌స్ట్రేట్ విధానాలు; మరోవైపు NADHతో అనుసంధానమైన జతలు. NADH సరఫరా, పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ కలిసి రంగు పదార్థం ఎంత వేగంగా క్షయీకరణ చెందుతుందో, ఎక్కడ విభజించబడి చేరుతుందో నిర్ణయిస్తాయి. ఆక్సీకరణ చెందిన సైటోక్రోమ్ c పక్కనే క్షయీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం అవసరమయ్యే మార్గం, ఆ ఎంపికపై ఆధారపడి ఉంటుంది.

తదుపరి బైపాస్ వాదనను ఎలా చదవాలి

ఏ కాంప్లెక్స్‌ను, ఏ నిరోధకంతో, ఏ స్థానం వద్ద, ఏ మోతాదుతో నిరోధించారో అడగండి. రంగు పదార్థం సాంద్రత ఎంత, కొలత ఎప్పుడు తీసుకున్నారో అడగండి. కణజాలం, జాతి, వేరుచేసిన విధానం, ప్రోటీన్ సాంద్రత, సబ్‌స్ట్రేట్ గురించి అడగండి. పొటెన్షియల్, శ్వాసక్రియ, రెడాక్స్ స్థితి, ప్రత్యక్ష బదిలీ పరీక్ష ఒకదానితో మరొకటి సరిపోతున్నాయో కూడా అడగండి. ఎందుకంటే ఇక్కడ ఆక్సిజన్ వినియోగం ఒక్కటే ఒకటి కంటే ఎక్కువసార్లు తప్పుదారి చూపించింది.

పరిమితమైన సారాంశమే నిలుస్తుంది. కాంప్లెక్స్ I చుట్టూ రంగు పదార్థం బైపాస్‌పై ఏకాభిప్రాయం ఉంది. కాంప్లెక్స్ III విషయంలో, యాంటిమైసిన్ mlకు 1 microgram, రంగు పదార్థం 1 micromolar ఉన్న ఎలుక మైటోకాండ్రియా కార్యాత్మక బైపాస్‌ను చూపలేదు. కానీ యాంటిమైసిన్ 0.3 micromolar లేదా మిక్సోథయాజోల్ 1 micromolar, రంగు పదార్థం 2 micromolar ఉన్న మూడు జాతులు, రంగు పదార్థం నుంచి సైటోక్రోమ్ cకి ప్రత్యక్ష బదిలీతో పాక్షిక బైపాస్‌ను చూపాయి. ఈ వాక్యాలు రెండూ ఒకేసారి నిజం కావచ్చు. వీటిని మించిన విస్తృత నిర్ధారణ ఏదైనా అందుబాటులోని ఫలితాలకు మించిన అన్వయం అవుతుంది.

సంబంధిత పఠనం, వివాదాస్పద వాదనను వివాదం లేని రసాయన ప్రక్రియల పరిధిలో ఉంచుతుంది: ఎలక్ట్రాన్‌ల రిలే కోసం మిథిలీన్ బ్లూ ఎలక్ట్రాన్లను ఎలా తరలిస్తుంది, గొలుసు ముందరి భాగంలో ఏకాభిప్రాయం ఉన్న సందర్భం కోసం కాంప్లెక్స్ I బైపాస్ ప్రయోగాలు, రెండు రంగు పదార్థాలు ఎందుకు అవసరమయ్యాయో తెలుసుకోవడానికి పొర విద్యుత్ పొటెన్షియల్ కొలతలు మరియు వాటిలోని తప్పుడు ప్రభావాలు, అలాగే మోతాదు, సమయం విషయంలోని చిక్కుల కోసం ప్రయోగశాలలో రెడాక్స్ చక్ర పదార్థాలను నిర్వహించే విధానాలు.