మైక్రోస్కోపీ కోసం మెథిలీన్ బ్లూకు ప్రత్యామ్నాయాలు: పనిని బట్టి ఎంచుకోండి

సాధారణ బ్యాక్టీరియా స్మియర్‌లో కణాల ఆకారాన్ని చూడటమే లక్ష్యమైతే, మెథిలీన్ బ్లూ స్థానంలో క్రిస్టల్ వైలెట్‌ను ఉపయోగించవచ్చు. సజీవ కణాల కోసం అయితే, ఎలాంటి స్టెయిన్ లేకుండా ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మెరుగైన ప్రత్యామ్నాయం కావచ్చు. మీరు చేయాల్సిన పరిశీలనపై ఎంపిక ఆధారపడి ఉంటుంది.

ఒకే బ్యాక్టీరియా కల్చర్‌ను ఇద్దరు వ్యక్తులు పరిశీలిస్తున్నారని అనుకుందాం. ఒకరు దండాకార కణాలను గుండ్రని కణాల నుంచి వేరు చేయాలనుకుంటున్నారు. మరొకరు ఒక చికిత్స బ్యాక్టీరియాను చంపిందా అని తెలుసుకోవాలనుకుంటున్నారు. మొదటి వ్యక్తికి స్పష్టమైన చిత్రం ఇచ్చే స్టెయిన్, రెండవ వ్యక్తికి ఉపయోగపడే సమాధానం ఇవ్వకపోవచ్చు.

ప్రత్యామ్నాయాన్ని ఎంచుకునే ముందు ఈ వాక్యాన్ని పూర్తి చేయండి: “నేను ___ లో ___ ను పరిశీలించాలి, మరియు కణాలు సజీవంగా ఉండాలి / ఉండాల్సిన అవసరం లేదు.” ఈ వాక్యమే స్టెయిన్ చేయాల్సిన పనిని నిర్వచిస్తుంది.

నమూనా మరియు ప్రశ్నతో ప్రారంభించండి

మొదట కణాలు సజీవంగా ఉండాలా అని నిర్ణయించండి, తరువాత మీరు పరిశీలించాల్సిన లక్షణాన్ని గుర్తించండి:

• కణాలు సజీవంగా ఉండాలి: కదలిక లేదా ఆకారం కోసం స్టెయిన్ చేయని ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ లేదా DIC‌ను పరిగణించండి; న్యూక్లియర్ DNA కోసం ఫ్లోరోసెన్స్‌తో Hoechst 33342ను పరిగణించండి; మెంబ్రేన్ సమగ్రత కోసం SYTO 9తో propidium iodide వంటి ధృవీకరించిన అసేను ఎంచుకోండి.
• కణాలు సజీవంగా ఉండాల్సిన అవసరం లేదు: బ్యాక్టీరియా మోర్ఫాలజీ కోసం క్రిస్టల్-వైలెట్ సింపుల్ స్టెయిన్ లేదా నిగ్రోసిన్ నెగటివ్ స్టెయిన్‌ను పరిగణించండి; Gram ప్రతిచర్య కోసం పూర్తి Gram-stain విధానాన్ని ఉపయోగించండి; స్థిరీకరించిన కణాల్లో న్యూక్లియర్ DNA కోసం DAPI ఫ్లోరోసెన్స్‌ను పరిగణించండి.

ప్రతి ఎంపికలోని పరిమితులను పోల్చడానికి ఈ పట్టికను ఉపయోగించండి. ఇవి విధాన ఎంపికలు మాత్రమే; ఇప్పటికే ఉన్న ప్రోటోకాల్‌లో ఒక బాటిల్‌ను మరొకదానితో మార్చే సూచనలు కావు.

సాధారణ స్మియర్ కోసం, విధానాన్ని జాగ్రత్తగా మార్చండి

బ్యాక్టీరియా మోర్ఫాలజీని ఒకే రంగులో చూడటం లక్ష్యమైతే క్రిస్టల్ వైలెట్ ఒక ఆచరణాత్మక ఎంపిక. FDA యొక్క Bacteriological Analytical Manualలో సింపుల్ స్టెయినింగ్‌కు అనుకూలమైన రెండు క్రిస్టల్-వైలెట్ ఫార్ములేషన్లు ఇవ్వబడ్డాయి. డాక్యుమెంట్ చేసిన ఫార్ములేషన్‌ను మరియు దాని తయారీ విధానాన్ని ఉపయోగించండి; డై పేరు మాత్రమే పనిచేసే రియాజెంట్‌ను నిర్వచించదు.

క్రిస్టల్ వైలెట్ Gram స్టెయినింగ్‌లో కూడా ఉంటుంది, కానీ అందువల్ల క్రిస్టల్-వైలెట్ సింపుల్ స్టెయిన్ Gram స్టెయిన్‌గా మారదు. ASM Gram-stain ప్రోటోకాల్లో భేదాత్మక ఫలితం క్రిస్టల్ వైలెట్, అయోడిన్, డీకలరైజేషన్, కౌంటర్‌స్టెయినింగ్ వరుసగా పనిచేయడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ఆ దశలను వదిలేస్తే చిత్రం ద్వారా నిర్ధారించగల విషయం మారుతుంది. ఈ తేడా కోసం సింపుల్ స్టెయినింగ్ మరియు Gram స్టెయినింగ్ మధ్య పోలిక చూడండి.

నిగ్రోసిన్ అవుట్‌లైన్‌లను కనిపించేలా చేయడానికి వేరే విధానాన్ని అందిస్తుంది: ఇది నేపథ్యాన్ని ముదురు చేస్తుంది, బ్యాక్టీరియా కణాలు తులనాత్మకంగా లేతగా ఉంటాయి. సాధారణ ప్రత్యామ్నాయాల జాబితాలో కనిపించకుండా పోయే ఉపయోగకరమైన వివరాన్ని Merck నిగ్రోసిన్ సూచనలు పేర్కొంటాయి. అందులో సూచించిన వర్కింగ్ ఫార్ములేషన్‌లో formaldehyde ఉంటుంది. అందువల్ల కణాలే స్టెయిన్ కాకుండా కనిపించినా, “నెగటివ్ స్టెయిన్” అనే పదాల ఆధారంగా సజీవ కణాలకు అనుకూలమని నిర్ణయించలేరు. పూర్తి ఫార్ములేషన్ మరియు నమూనా తయారీని తనిఖీ చేయండి.

సజీవ నమూనాల కోసం, ఆప్టిక్స్‌ను మార్చడాన్ని పరిగణించండి

కణాలు కదలడం లేదా విభజించడం చూడాలనుకుంటే, మరో డైను చేర్చడం పరిశీలనను క్లిష్టం చేయవచ్చు. Nikon తన పారదర్శక నమూనాల్లో కాంట్రాస్ట్ మార్గదర్శకంలో వివరించినట్లుగా, ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మరియు differential interference contrast, లేదా DIC, వాటి ఆప్టికల్ లక్షణాల్లోని తేడాల ద్వారా నమూనాలను కనిపించేలా చేస్తాయి. మైక్రోస్కోప్‌లో అవసరమైన భాగాలు ఉంటే, ఇవి సజీవంగా ఉన్న, స్టెయిన్ చేయని కణాలను చూపగలవు.

ఈ ఎంపిక స్టెయిన్ చేయని ప్రిపరేషన్‌ను అలాగే ఉంచుతుంది, కానీ అందుబాటులో ఉండే సమాచారాన్ని మారుస్తుంది. కాంట్రాస్ట్‌ను ఏ అణువు సృష్టించిందో తెలియకుండానే ఒక సరిహద్దును లేదా కదలికను అనుసరించవచ్చు. అణువుల స్థాన నిర్ధారణే ప్రశ్న అయితే, దానికి తగిన లేబెలింగ్ విధానాన్ని ఎంచుకోండి.

న్యూక్లియర్ DNA కోసం, Invitrogen యొక్క DAPI మరియు Hoechst స్టెయిన్‌ల పోలికలో DAPIని సాధారణంగా స్థిరీకరించిన కణాలతో ఉపయోగించడం, మరింత సులభంగా కణంలోకి ప్రవేశించే Hoechst 33342ను సజీవ కణాల లేబెలింగ్ కోసం ప్రాధాన్యంగా ఉపయోగించడం మధ్య తేడాను చూపిస్తుంది. రెండింటికీ ఫ్లోరోసెన్స్ పరికరాలు అవసరం. ఇవి రెండూ రంగుతో కనిపించే బ్రైట్‌ఫీల్డ్ స్టెయిన్‌కు ప్రత్యక్ష ప్రత్యామ్నాయాలు కావు.

డై ఎక్స్‌పోజర్ మరియు ఇల్యూమినేషన్‌ను ప్రయోగ పరిస్థితులుగా పరిగణించండి. కణాల ప్రవర్తనే మీ కొలమానం అయితే స్టెయిన్ చేసిన మరియు స్టెయిన్ చేయని ప్రిపరేషన్‌లను పోల్చండి.

ఎరుపుగా కనిపించే కణం తప్పనిసరిగా చనిపోయిన కణం కాదు

బ్యాక్టీరియా మెంబ్రేన్ సమగ్రతను అంచనా వేయడానికి SYTO 9 మరియు propidium iodideను తరచుగా కలిపి ఉపయోగిస్తారు. BacLight మాన్యువల్ సమగ్రంగా ఉన్న మెంబ్రేన్‌లను ఆకుపచ్చ స్టెయినింగ్‌తో, దెబ్బతిన్న మెంబ్రేన్‌లను ఎరుపు స్టెయినింగ్‌తో అనుసంధానిస్తుంది. ఆ వ్యాఖ్యానాన్ని ఉపయోగించే నమూనాకు అనుగుణంగా ధృవీకరించాలి.

Rosenberg మరియు సహచరులు చేసిన 2019 అధ్యయనం ఈ సమస్యను చూపిస్తుంది. phosphate-buffered salineలో గాజుపై ఉన్న 24-hour E. coli బయోఫిల్మ్‌లలో, సుమారు 96% కణాలు వాటి అసలు స్థానంలో propidium-iodide-positiveగా కనిపించాయి. అయినప్పటికీ, సేకరించిన తరువాత 82% కణాలు కల్చర్ చేయదగినవని రచయితలు అంచనా వేశారు. కాన్ఫోకల్ చిత్రాల్లో ఎరుపుగా స్టెయిన్ అయిన పదార్థం కింద ఆకుపచ్చ అంతర్భాగాలతో ఉన్న కణాలు కనిపించాయి; తప్పుదారి పట్టించే సంకేతానికి extracellular nucleic acids కారణమని ఇది సూచించింది.

ఆ శాతాలు అధ్యయనంలోని ప్రిపరేషన్‌లపై చేసిన వేర్వేరు కొలతలను వివరిస్తాయి; అవి సార్వత్రిక సవరణ గుణకం కావు. సంకేతాన్ని ఏమి సృష్టించిందో తనిఖీ చేయడమే ఉపయోగకరమైన పాఠం. బయోఫిల్మ్‌లో, nucleic-acid డై దెబ్బతిన్న కణాల లోపల ఉన్న పదార్థంతో పాటు కణాల బయట ఉన్న పదార్థాన్ని కూడా గుర్తించగలదు. జీవనక్షమతపై నిర్ణయం కోసం, ప్రతి విధానానికీ పరిమితులు ఉన్నాయని గుర్తిస్తూ, కల్చివేషన్ లేదా మెటబాలిక్ యాక్టివిటీ వంటి పరిపూరక కొలతలను పరిశోధకులు సిఫార్సు చేస్తున్నారు.

ప్రత్యామ్నాయంలో నిజంగా ఏముందో తనిఖీ చేయండి

ప్రత్యామ్నాయ స్టెయినింగ్ విధానంలో కూడా మెథిలీన్ బ్లూ ఉండవచ్చు. Giemsa ఒక ఉదాహరణ: Merck తన ఉత్పత్తిని azure-eosin-methylene-blue solutionగా వివరిస్తుంది; ఇది రక్తం మరియు బోన్-మారో స్మియర్‌లతో సహా వివిధ ఉపయోగాల కోసం ఉద్దేశించబడింది. వేరే నమూనాకు ఇది వేరే విధానం కావచ్చు, కానీ మెథిలీన్ బ్లూను మినహాయించాలనే అవసరాన్ని ఇది తీర్చదు.

ఒక సమ్మేళనాన్ని మినహాయించడం ప్రయోగంలో భాగమైతే, చిత్రాలను పోల్చే ముందు రియాజెంట్ గుర్తింపు మరియు ఫార్ములేషన్‌ను తనిఖీ చేయండి. methyl blue, methylene blue మరియు ఇలాంటి పేర్లు కలిగిన డైలు గురించి మార్గదర్శకం పేర్ల మధ్య తేడాలను వివరిస్తుంది.

ఫలితాన్ని ఉపయోగించే ముందు ప్రత్యామ్నాయాన్ని ధృవీకరించండి

కొత్త విధానం కోసం, ప్రతినిధి నమూనాలు మరియు తగిన కంట్రోల్‌తో చిన్న పోలిక చేయండి. సాధ్యమైనంత వరకు మైక్రోస్కోప్ సెట్టింగ్‌లను పోల్చదగిన విధంగా ఉంచండి. రియాజెంట్ ఫార్ములేషన్, నమూనా తయారీ, ఎక్స్‌పోజర్, ఇమేజింగ్ పరిస్థితులను నమోదు చేయండి; తద్వారా మెరుగ్గా కనిపించే చిత్రాన్ని కేవలం ఇష్టపడటం కాకుండా దాని కారణాన్ని పరిశీలించవచ్చు.

విజయాన్ని అసలు ప్రశ్నకు అనుగుణంగా అంచనా వేయండి. మోర్ఫాలజీ కోసం, కణాల సరిహద్దులు మరియు అమరికను ఇంకా స్పష్టంగా అర్థం చేసుకోగలమా అని పరిశీలించండి. న్యూక్లియర్ లేబెలింగ్ కోసం సంకేత స్థానం మరియు నేపథ్యాన్ని అంచనా వేయండి. జీవనక్షమత కోసం, ఆకర్షణీయమైన రంగు విభజనకంటే ఎక్కువ ఆధారాన్ని కోరండి. విస్తృతమైన మెథిలీన్ బ్లూ స్టెయినింగ్ మరియు ప్రయోగశాల అనువర్తనాల మార్గదర్శకం పరిశీలన మరియు ప్రిపరేషన్ ఒకదానితో ఒకటి ఎలా సరిపోతాయో వివరిస్తుంది.

మీకు అవసరమైన కొలతను కాపాడే ప్రత్యామ్నాయాన్ని ఎంచుకోండి. ఫలిత చిత్రంలో రంగు కేవలం ఒక లక్షణం మాత్రమే.