మిథిలీన్ బ్లూ మరియు ఫెర్రోప్టోసిస్: ఇనుము, లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్, కణ మరణం

ఫెర్రోప్టోసిస్ అంటే పొర దెబ్బతినడం వల్ల సంభవించే కణ మరణం. పొరల్లోని పాలీఅన్‌సాచురేటెడ్ కొవ్వులు గొలుసు ప్రతిచర్యలో ఆక్సీకరణ చెందుతాయి, పొర తన పనితీరును కోల్పోతుంది, కణం మరణిస్తుంది. ఈ రసాయన ప్రక్రియకు ఇనుము అవసరం. మొత్తం భావన ఆ ఒక్క వాక్యంలోనే ఉంది; ఈ వ్యాసంలోని ప్రతి అంశం దానిలోని ఏదో ఒక భాగాన్ని పరీక్షిస్తుంది.

ఇక్కడి ప్రశ్న మరింత నిర్దిష్టమైనది: కణ ప్రయోగాల్లో మిథిలీన్ బ్లూ ఆ గొలుసు ప్రతిచర్యపై ఎలాంటి ప్రభావం చూపుతుంది, ఆ ఫలితం నిజంగా ఏమి తెలియజేస్తుంది? సంక్షిప్త సమాధానం ఏమిటంటే, రెండు ప్రయోగశాల అధ్యయనాల్లో nanomolar స్థాయిలోని మిథిలీన్ బ్లూ మైటోకాండ్రియల్ లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌ను తగ్గించింది; సాధారణంగా ఫెర్రోప్టోసిస్‌కు కారణమయ్యే ప్రేరకాల తరువాత కూడా కణాలను సజీవంగా ఉంచింది. అయితే విపులమైన సమాధానం మరింత ముఖ్యం, ఎందుకంటే ఈ శ్రేణిలోని ప్రతి దశను వేర్వేరు జోక్యాలతో పరీక్షించారు, ప్రతి జోక్యానికీ పరిమితులు ఉన్నాయి.

ఒక పేరాలో ఫెర్రోప్టోసిస్

పాలీఅన్‌సాచురేటెడ్ ఫ్యాటీ యాసిడ్ తోకను కలిగిన పొర ఫాస్ఫోలిపిడ్‌లో ఒక బలహీన స్థానం ఉంటుంది: సులభంగా లాక్కోగల హైడ్రోజన్ పరమాణువులు. ఒక రాడికల్ వాటిలో ఒకదాన్ని లాక్కున్న తరువాత, లిపిడ్‌కు ఆక్సిజన్ చేరుతుంది, లిపిడ్ పెరాక్సిల్ రాడికల్ ఏర్పడుతుంది, ఆ రాడికల్ పక్కనున్న లిపిడ్ నుంచి హైడ్రోజన్‌ను లాక్కుంటుంది. ఏదైనా దాన్ని ఆపకపోతే, ప్రతిచర్య పొర వెంబడి వ్యాపిస్తుంది.

దీనిని ఆపే ప్రధాన యంత్రాంగం GPX4 అనే ఎంజైమ్. ఇది గ్లూటాథయోన్‌ను ఉపయోగించి లిపిడ్ పెరాక్సైడ్‌లను హానిరహిత లిపిడ్ ఆల్కహాల్‌లుగా క్షయీకరిస్తుంది. ప్రయోగశాల ప్రేరకాలు ఈ రక్షణ వ్యవస్థలోని నిర్దిష్ట దశలపై దాడి చేస్తాయి. ఎరాస్టిన్, సిస్టమ్ xc-మైనస్ ద్వారా సిస్టిన్ లోపలికి రావడాన్ని అడ్డుకుంటుంది; దాంతో గ్లూటాథయోన్ సంశ్లేషణకు అవసరమైన సిస్టీన్ కణానికి అందకుండా పోతుంది. బ్యూథియోనైన్ సల్ఫాక్సిమైన్ గ్లూటాథయోన్ సంశ్లేషణను నేరుగా అడ్డుకుంటుంది. RSL3, GPX4నే నిరోధిస్తుంది. ఈ మూడూ పెరాక్సైడ్‌లు తొలగించబడకుండా చేస్తాయి, కానీ వేర్వేరు దశల్లో అలా చేస్తాయి. కాబట్టి ఒక ప్రేరకంతో వచ్చిన ఫలితం మిగిలిన వాటికీ స్వయంచాలకంగా వర్తించదు.

ఫెర్రోప్టోసిస్‌ను నిర్వచించే లక్షణాలు దాన్ని అపోప్టోసిస్ నుంచి వేరు చేస్తాయి. ఇందులో కాస్పేస్ ప్రతిచర్యల పరంపర ఉండదు, అపోప్టోటిక్ బాడీలు కూడా ఉండవు. డిఫెరాక్సమైన్ వంటి ఇనుము కీలేటర్లు, ఫెర్రోస్టాటిన్-1 వంటి రాడికల్‌లను బంధించే పదార్థాలు దీన్ని అణచివేస్తాయి. ఒక కణ మరణాన్ని కేవలం నెక్రోటిక్ మరణంగా కాకుండా ఫెర్రోప్టోటిక్ మరణంగా గుర్తించడానికి పరిశోధకులు ఉపయోగించే కార్యాత్మక పరీక్ష ఇదే. నియంత్రిత కణ మరణ మార్గాల విస్తృత అవగాహన ఈ తేడాకు సందర్భాన్ని అందిస్తుంది. అలాగే, సులభంగా ప్రతిచర్యల్లో పాల్గొనే ఇనుమును కణాలు ఎలా నిర్వహిస్తాయో తెలుసుకుంటే, కీలేషన్ అంత నిర్ణయాత్మకమైన నియంత్రణ పరీక్ష ఎందుకో అర్థమవుతుంది.

మైటోకాండ్రియా పాత్ర ఏమిటి, దానిపై వివాదం ఎందుకు వచ్చింది

మైటోకాండ్రియల్ DNA లేని కణాల్లో కూడా ఫెర్రోప్టోసిస్ సంభవిస్తుందని తొలి పరిశోధనలు తెలిపాయి. దాంతో మైటోకాండ్రియా తప్పనిసరి కాకపోవచ్చని భావించారు. తరువాతి పరిశోధనలు మైటోకాండ్రియాను తగ్గించడం లేదా కణ శ్వాసక్రియను అడ్డుకోవడం వల్ల సిస్టీన్ కొరతతో సంభవించే ఫెర్రోప్టోసిస్‌ను అణచవచ్చని, కానీ నేరుగా GPX4ను నిరోధించడం వల్ల సంభవించే ఫెర్రోప్టోసిస్‌ను అణచలేమని కనుగొన్నాయి. మైటోకాండ్రియా పాత్ర ప్రేరకం, కణ రకం, నిర్ణయాత్మక పెరాక్సిడేషన్ జరిగే స్థానం మీద ఆధారపడితే, ఈ రెండు ఫలితాలూ నిజం కావచ్చు.

ఈ వ్యాసానికి ఆధారమైన అధ్యయనం ఒక నిర్దిష్ట కణ విభాగాన్ని పరిశీలించే ప్రోబ్‌తో ఈ వివాదాన్ని పరిశీలించింది. MitoCLox అనేది లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌ను సూచించే రిపోర్టర్‌కు మైటోకాండ్రియాను లక్ష్యంగా చేసుకున్న రూపం: మైటోకాండ్రియా లోపల లిపిడ్ పెరాక్సిల్ రాడికల్‌లను ఎదుర్కొన్నప్పుడు దాని ఫ్లోరోసెన్స్ మారుతుంది. ఎరాస్టిన్‌తో చికిత్స చేసిన ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో, మరణానికి ముందే ఇంకా సజీవంగా ఉన్న కణాల్లో మైటోకాండ్రియల్ ప్రోబ్ ఆక్సీకరణ కనిపించింది. కణ సమూహమంతటా అది ఒకేలా లేదు. ఆ సమయ క్రమం ముఖ్యం. మరణానికి ముందు జరిగే పెరాక్సిడేషన్ ఒక సంభావ్య కారణం. మృత కణాల్లో మాత్రమే కొలిచిన పెరాక్సిడేషన్ మాత్రం అవశేషం. ప్రోబ్ ఉన్న స్థానం సంకేతం అర్థాన్ని ఎందుకు నిర్ణయిస్తుందో లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్ పరీక్షలు, ప్రతి ప్రోబ్ ఏమి సూచిస్తుంది అనే అనుబంధ మార్గదర్శిని వివరిస్తుంది.

రెండో నమూనాలోనూ ఇదే క్రమం కనిపించింది. లీబర్ వంశపారంపర్య ఆప్టిక్ న్యూరోపతి ఉన్న ఒక రోగి నుంచి తీసుకున్న ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో కాంప్లెక్స్ I జన్యు మార్పు, అధిక ప్రాథమిక ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి ఉన్నాయి. గ్లూటాథయోన్‌ను తగ్గించినప్పుడు అవి ఫెర్రోప్టోసిస్ ద్వారా మరణించగా, నియంత్రణ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు దాన్ని తట్టుకున్నాయి. మైటోకాండ్రియల్ ప్రోబ్ ఆక్సీకరణ మళ్లీ ముందుగా కనిపించింది. వివరాలు ఫెర్రోప్టోసిస్‌లో మైటోకాండ్రియల్ లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌పై ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ అధ్యయనంలో ఉన్నాయి.

ఈ ప్రయోగాల్లో మిథిలీన్ బ్లూ ఏమి మార్చింది

మిథిలీన్ బ్లూ ఒక రెడాక్స్ వాహకం. దాని ఆక్సీకృత రూపం కాంప్లెక్స్ I వద్ద NADHతో అనుసంధానమైన రసాయన ప్రక్రియ నుంచి ఎలక్ట్రాన్‌లను స్వీకరిస్తుంది. దాని క్షయీకృత రూపం వాటిని సైటోక్రోమ్ cకి అందిస్తుంది; అది కాంప్లెక్స్ IVకి ఎలక్ట్రాన్‌లను సరఫరా చేస్తుంది. దీంతో ఎలక్ట్రాన్‌లు సాధారణంగా ఆక్సిజన్‌కు లీకై సూపర్‌ఆక్సైడ్ ఏర్పరిచే శ్రేణి భాగం చుట్టూ ఒక పాక్షిక ప్రత్యామ్నాయ మార్గం ఏర్పడుతుంది. పూర్తి ఎలక్ట్రాన్ బదిలీ క్రమాన్ని తెలుసుకోవాలనుకునే పాఠకులు మైటోకాండ్రియా ద్వారా మిథిలీన్ బ్లూ ఎలక్ట్రాన్‌లను ఎలా తరలిస్తుందితో ప్రారంభించవచ్చు.

ఎరాస్టిన్‌తో చికిత్స చేసిన ఊపిరితిత్తుల ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో, 250 nanomolar మిథిలీన్ బ్లూ కణ జీవన పరీక్షలో జీవసామర్థ్యాన్ని నిలిపింది. మైటోకాండ్రియాను లక్ష్యంగా చేసుకున్న యాంటీఆక్సిడెంట్లు SkQ1, MitoTEMPO కూడా అదే విధంగా పనిచేశాయి. నియంత్రణ పరీక్షలే ఈ నిర్ధారణ పరిధిని నిర్ణయిస్తాయి. ఫెర్రోస్టాటిన్-1, ఆల్ఫా-టోకోఫెరాల్, డిఫెరాక్సమైన్ కూడా రక్షణనిచ్చాయి; ఇది ఆ మరణం ఫెర్రోప్టోటిక్ అని నిర్ధారిస్తుంది. యాంటీఆక్సిడెంట్ సమూహం లేని SkQ1 సదృశ సమ్మేళనం రక్షణ ఇవ్వలేదు. ఇది నిర్దిష్టత లేని సంచయం కంటే రెడాక్స్ రసాయన ప్రక్రియ పాత్రను సూచిస్తుంది. SkQ1 సాంద్రత సుమారు 200 nanomolar దాటినప్పుడు రక్షణ తగ్గింది. అధిక పరిమాణాల్లో క్వినోన్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు ఆక్సీకరణను ప్రోత్సహిస్తాయనే తెలిసిన ప్రవర్తనకు ఇది అనుగుణంగా ఉంది. మిథిలీన్ బ్లూలోనూ సాంద్రతను బట్టి ఈ రెండు విరుద్ధ ప్రభావాలు ఉంటాయి: ఈ ప్రయోగ పాత్రల్లో తక్కువ nanomolar స్థాయుల్లో రక్షణనిస్తుంది; సాంద్రతను పెంచినప్పుడు లేదా బలమైన కాంతికి గురిచేసినప్పుడు రెడాక్స్ సైక్లింగ్ ద్వారా హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్‌ను ఉత్పత్తి చేయగలదు. ఈ తరహా మోతాదు సందర్భాన్ని మైటోకాండ్రియాలో ప్రతిచర్యాశీల ఆక్సిజన్ జాతులు వివరిస్తుంది.

తరువాత వేరుచేసిన మైటోకాండ్రియాపై చేసిన ప్రయోగాలు ROS మూలాలను విడివిడిగా పరిశీలించాయి. ఫెర్రస్ ఇనుము ఉన్నప్పుడు, కాంప్లెక్స్ Iకి సరఫరా చేసే సబ్‌స్ట్రేట్‌లతో పాటు రోటెనోన్‌ను జోడించడం ప్రోబ్ ఆక్సీకరణను ప్రేరేపించింది. రోటెనోన్ ఫ్లావిన్ స్థానం తరువాతి భాగాన్ని అడ్డుకుంటుంది. అందువల్ల ముందు భాగంలోని వాహకాలు క్షయీకృత స్థితిలో ఉండిపోతాయి; మ్యాట్రిక్స్ వైపు ఉన్న ఫ్లావిన్ నుంచి ఎలక్ట్రాన్‌లు ఆక్సిజన్‌కు లీకవుతాయి. కాంప్లెక్స్ IIIకి సరఫరా చేసే సబ్‌స్ట్రేట్‌లతో పాటు యాంటిమైసిన్ Aను జోడించడం అధిక మొత్తంలో హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్‌ను ఉత్పత్తి చేసింది, అయినా లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌ను ప్రేరేపించలేదు. మొత్తం ROS సంకేతం ఒకటే అయినా, స్థానం వేరు, ఫలితం వేరు. SkQ1, మిథిలీన్ బ్లూ రెండూ హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ ఉత్పత్తిని అణచకుండానే కాంప్లెక్స్ I ప్రేరేపించిన పెరాక్సిడేషన్‌ను అణచాయి. అంటే వాటి చర్య ROS ఏర్పడిన తరువాత, లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్ దశలో ఉందని సూచిస్తుంది.

అధిక ఇనుముతో చేసిన ప్రయోగ విభాగం, లిపోఫసిన్ సూచన

రెండో అధ్యయనం ఈ ప్రశ్నను ఇనుము వైపు నుంచి పరిశీలించింది. submillimolar సాంద్రతలో ఫెర్రిక్ అమ్మోనియం సిట్రేట్‌కు గురిచేసిన H9c2 కార్డియోమయోసైట్‌లలో మొదట మైటోకాండ్రియల్ ROS, తరువాత మైటోకాండ్రియల్ లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్, ఆ తరువాత ఫెర్రోప్టోసిస్ ఏర్పడ్డాయి. వాటి తరువాత 24 hours లోపు లిపోఫసిన్‌ను పోలిన వర్ణద్రవ్యం పేరుకుంది. లిపోఫసిన్ అనేది ఆక్సీకరణ చెందిన లిపిడ్‌లు, ప్రోటీన్‌ల నుంచి మిగిలే, ఇనుమును కలిగిన, స్వయంగా ఫ్లోరోసెన్స్ చూపే అవశేషం. ఇది వయసుతో పాటు పేరుకుపోతుంది. ఇక్కడ అది వేగంగా కనిపించడం, ఇనుము ప్రేరేపించిన తీవ్ర పెరాక్సిడేషన్‌ను వృద్ధాప్యానికి సంబంధించిన ఒక ప్రసిద్ధ సూచికతో అనుసంధానిస్తుంది. nanomolar స్థాయిలోని మిథిలీన్ బ్లూ, SkQ1 రెండూ పెరాక్సిడేషన్‌ను, కణ మరణాన్ని, వర్ణద్రవ్యం పేరుకోవడాన్ని నిరోధించాయి. వేరుచేసిన గుండె మైటోకాండ్రియా కూడా ఈ క్రమాన్ని నిర్ధారించాయి: రోటెనోన్‌తో పాటు ఫెర్రస్ ఇనుము పెరాక్సిడేషన్‌ను, వర్ణద్రవ్యం వంటి సంకేతాన్ని ప్రేరేపించాయి; రెండు పదార్థాలూ దాన్ని అడ్డుకున్నాయి. పూర్తి క్రమం H9c2 కార్డియోమయోసైట్‌లలో అధిక ఇనుముపై అధ్యయనంలో నివేదించబడింది. ఈ కథనంలోని వర్ణద్రవ్యానికి సంబంధించిన అంశాన్ని లిపోఫసిన్, కణ వృద్ధాప్య సూచికలుతో కలిపి చూడాలి.

కణ జీవన పరీక్షలు ఏమి చూపించవు

CellTiterBlue వంటి జీవసామర్థ్య పరీక్ష, ఒక ప్రేరకాన్ని, రక్షణ ఇవ్వవచ్చని భావించే పదార్థాన్ని జోడించిన తరువాత ప్రయోగ పాత్రలో ఎన్ని కణాలు జీవక్రియాపరంగా చురుకుగా ఉన్నాయో సూచిస్తుంది. ఇది ఒక నిర్దిష్ట వ్యవస్థలో ఒక ప్రక్రియను పరీక్షించడం మాత్రమే. ఇది చికిత్స ఫలితం కాదు. ఈ ప్రయోగాల్లో ఏదీ రోగికి మోతాదు ఇవ్వలేదు, వ్యాధికి సంబంధించిన ఫలిత సూచికను కొలవలేదు, శరీరంలో చికిత్సకు అనుకూలమైన సురక్షిత మోతాదు పరిధిని నిర్ధారించలేదు.

నాలుగు పరిమితులను స్పష్టంగా చెప్పాలి. మొదటిది, ఉపయోగించిన కణ రకాలు పరిమితమైనవి: రూపాంతరం చెందిన ఊపిరితిత్తుల ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు, ఒక మైటోకాండ్రియల్ వ్యాధికి సంబంధించిన కణ శ్రేణితో సహా ప్రాథమిక చర్మ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు, ఒక ఎలుక కార్డియోమయోసైట్ శ్రేణి, అలాగే వేరుచేసిన ఎలుక గుండె మైటోకాండ్రియా. సున్నితత్వం కణ శ్రేణిని బట్టి మారింది; అధ్యయన రూపకల్పన ప్రకారమే LHON శ్రేణి అసాధారణంగా ఎక్కువ సున్నితత్వం కలిగినది. రెండోది, ప్రేరకాలు ప్రయోగశాలకు పరిమితమైన తీవ్ర పరిస్థితులు: రవాణాను లేదా సంశ్లేషణను పూర్తిగా అడ్డుకోవడం, ఏ కణజాలమూ అకస్మాత్తుగా ఎదుర్కోని స్థాయిలో ఇనుము భారం. మూడోది, సాంద్రతను కేవలం గుణించడం ద్వారా మానవ మోతాదుగా మార్చలేం. కల్చర్ మాధ్యమంలోని nanomolar సాంద్రత మానవ మోతాదు కాదు. మిథిలీన్ బ్లూ పంపిణీ, రక్తం మరియు కణజాలంలో అది రంగులేని రూపానికి క్షయీకరణ చెందడం, కాంతికి గురికావడం, పొర విద్యుత్ సంభావ్యత—ఇవన్నీ ప్రయోగ పాత్రలోని పరిస్థితికీ మనిషిలోని పరిస్థితికీ మధ్య ఉంటాయి. నాలుగోది, ప్రోబ్‌లు తాము ఉన్న కణ విభాగం గురించి మాత్రమే సూచిస్తాయి. MitoCLox ఆక్సీకరణ మైటోకాండ్రియల్ లిపిడ్ రాడికల్‌లు ఏర్పడ్డాయని చూపుతుంది. అంతిమ ఘటనగా భావించే ప్లాస్మా పొర చీలికను ముందరి దశల్లో నివారించడం కాకుండా నేరుగా అడ్డుకున్నారని అది చూపదు.

కాబట్టి ఆధారాలకు కట్టుబడిన నిర్ధారణ ఇదే: ఈ నమూనాల్లో, కాంప్లెక్స్ I నుంచి ఏర్పడిన ROSతో పాటు ఇనుము, ఫెర్రోప్టోసిస్‌కు ముందు జరిగే మైటోకాండ్రియల్ లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తాయి; తక్కువ సాంద్రతల్లో మిథిలీన్ బ్లూ ఆ శ్రేణిలోని ఆ భాగాన్ని అడ్డుకుంటుంది. ఆ భాగాన్ని మించిన ఏ నిర్ధారణకైనా మొదట జంతువుల్లో, తరువాత మనుషుల్లో వేరే ప్రయోగాలు అవసరం.