Paul Ehrlich och metylenblått: hur ett färgämne bidrog till läkemedelsutvecklingen

Paul Ehrlichs bidrag till medicinen var inte ett läkemedel. Det var ett resonemang om hur man skulle undersöka ett.

År 1878 lämnade han in en doktorsavhandling vars inledande avsnitt hette ”Den kemiska synen på färgning”. Resonemanget var att färgning av ett vävnadssnitt och färgning av ett tygstycke följer samma logik. I båda fallen fäster färgen på grund av en kemisk affinitet mellan färgämnet och materialet, inte för att vävnaden är absorberande, fet eller formad så att den fångar ett pigment. Ehrlich hade under uppväxten sett sin kusin, patologen Karl Weigert, framställa färgade snitt. Det som fångade hans uppmärksamhet var inte bilderna, utan att färgämnet valde var det hamnade.

Påståendet låter blygsamt. Det är det inte. Om ett färgämne binder till en vävnad av kemiska skäl, så berättar färgningsmönstret något om vävnadens kemi. Ett färgat objektglas upphör att vara en illustration och blir en mätning.

Han byggde genast vidare på detta. År 1880 kombinerade han metylenblått med surt fuksin och kallade blandningen en neutral färgning, ett neutralt färgämne, som skilde de olika typerna av vita blodkroppar åt där de enskilda färgämnen som då användes inte räckte till. Två år senare presenterade han en metod med metylviolett för färgning av tuberkelbaciller, och Koch tog upp förfarandet i sitt eget arbete.

Teorin som senare gav dessa metoder en gemensam grund är en annan fråga, och dess datering förenklas ofta. Ehrlichs sidokedjeteori, idén att ett ämne verkar på en cell eftersom de två är kemiskt förenliga, hör till 1890-talet, inte till åren med färgämnesexperiment. Det tidigare arbetet gav den föregående övertygelsen: selektivitet är kemisk, och därför går det att söka efter selektivitet i stället för att snubbla över den.

Experimentet som gjorde färgämnet till en karta

År 1885 publicerade Ehrlich en monografi om organismens syrebehov, med undertiteln en färganalytisk studie. Metoden gick ut på att injicera färgämnen vars färg beror på oxidationstillståndet och sedan jämföra hur olika organ reducerade dem eller bevarade dem oförändrade. Färgämnet användes som ett instrument, på samma sätt som en termometer: det gav information om förhållanden inne i vävnaden som inte kunde undersökas direkt. Ehrlich beskrev själv målet som att med hjälp av vissa färgämnen bestämma levande organs reduktionsförmåga.

Resultatet med metylenblått kom 1886, i en artikel om färgämnets reaktion med levande nervsubstans, som hade föredragits inför ett medicinskt sällskap föregående december. Metylenblått fördes in i blodcirkulationen hos ett levande djur, varefter tunna vävnadssnitt togs ut och exponerades för luft. Då oxiderades det ansamlade färglösa färgämnet tillbaka till blått och visade var det hade samlats. Nervceller och nervfibrer tog upp färgen, och gjorde det tillräckligt selektivt för att tekniken skulle bli en standardmetod för att synliggöra nervvävnad. Föreningen var inte längre bara ett färgämne som applicerades på ett dött snitt på en arbetsbänk. Den var en markör som fördelade sig inne i en levande kropp, och fördelningen gick att avläsa.

Egenskapen bakom båda experimenten behöver uttryckas tydligt, eftersom allt annat i den här berättelsen beror på den. Metylenblåtts omvandling är reversibel. Dess reducerade form, leukometylenblått, är färglös, och vid kontakt med syre återgår den till den blå katjonen. En glukoslösning med färgämnet i en försluten burk är färglös; öppna burken och den blir blå. Ehrlich uppges ha visat detta direkt genom att behandla färgade snitt med järnklorid såväl som luft och se färgen återkomma. Ett färgämne som ändrar färg med omgivningens redoxtillstånd är en sond för den omgivningen.

Två egenskaper stod alltså sida vid sida. Ett färgämne kunde skilja en vävnad från en annan. Och ett färgämne kunde slås på och av genom en förändring av oxidationstillståndet.

Sett i efterhand är den andra egenskapen början på kemoterapin. Om en förening binder till en sorts vävnad men inte en annan, skulle samma förening kunna nå en sorts organism men inte en annan. Ehrlich formulerade slutsatsen direkt: om en patogen kunde färgas selektivt, kunde färgningen tyda på en specifik skadlig verkan på just den patogenen. Ett färgämne skulle därför kunna användas som läkemedel, riktat mot en inkräktare snarare än mot patienten.

Det första försöket på en patient gällde inte malaria. År 1890 rapporterade Ehrlich tillsammans med psykiatern Arthur Leppmann att metylenblått lindrade smärta vid neuralgiska och reumatiska tillstånd i muskler, leder och senor. De två diskuterade om läkemedlet kunde verka vid psykisk sjukdom och bestämde sig för att inte pröva det. En italiensk läkare, Pietro Bodoni i Genua, gick ändå vidare. Hans artikel från 1899 har en titel som anger en sederande verkan vid olika former av psykos: han beskrev lugnande effekter hos fjorton agiterade patienter och noterade att andra läkare i Genua redan använde färgämnet i samma syfte. Sedering är inte en effekt på sjukdomen, och den skillnaden återkommer gång på gång i denna historia.

Arbetet med malaria kom 1891, tillsammans med patologen Paul Guttmann vid Moabitsjukhuset i Berlin. Metylenblått gavs till två patienter, och rapporten publicerades i Berliner klinische Wochenschrift den 28 september 1891. I det första fallet tog patienten 0.5 g av färgämnet på en gång på kvällen den 29 juni; det väntade anfallet utvecklades inte fullt ut, och det enda besvär som dokumenterades efteråt var lindrig stranguri med blå urin. Feberanfallen försvann under de första dagarna, och parasiterna var borta ur blodet senast den åttonde dagen. Författarnas egen sammanfattning var att deras förväntningar hade uppfyllts helt. Två okontrollerade fall är inget bevis. Den utförligare redogörelsen för metylenblått och malaria, inklusive de moderna prövningarna, hör hemma på en egen sida. Den intressanta frågan här är snävare: hur mycket av Ehrlichs resonemang höll när det mötte parasiten?

Var resonemanget höll och var det brast

Inte mycket av mekanismen höll, åtminstone inte i den form Ehrlich föreslog. Den prydliga förklaringen, där en plan tricyklisk katjon glider in mellan basparen i parasitens DNA, håller inte för Plasmodium. Metylenblått reduceras så lätt av en infekterad röd blodkropp att det aldrig når parasiten som en plan katjon, och interkalationsförklaringen som passar akridinfärgämnena passar inte detta färgämne.

Det som beläggen faktiskt stöder är mindre prydligt. Metylenblått hämmar parasitens glutationreduktas vid koncentrationer som kan uppnås hos en patient. Det blockerar omvandlingen av hem till hemozoin, det inerta pigment som parasiten bildar för att undvika att förgiftas av sin egen nedbrytning av hemoglobin, ungefär lika effektivt som klorokin och betydligt effektivare än kinin. Dess redoxcykling alstrar också reaktiva syreföreningar i en cell som redan producerar dem. Vilken av dessa som är den egentliga mekanismen, eller om alla bidrar, är fortfarande inte klarlagt.

Det finns ytterligare en komplikation, och den bör påverka hur varje historiskt påstående om denna förening läses. Kommersiellt metylenblått från den perioden var inte ett enda ämne. Prover innehöll azure B, den monodemetylerade analogen, och äldre lösningar ansamlade mer av det. Azure B är ett metakromatiskt färgämne med andra mål: det färgar dubbelsträngat DNA djupblått och RNA grönt. En blandning av två färgämnen som hamnar på olika ställen, i proportioner som ingen dokumenterade, kan inte ligga till grund för ett entydigt påstående om vad metylenblåttet i blandningen gjorde.

Färgämnet självt ersatte aldrig kinin. Metoden klarade sig bättre. Ehrlichs elev Wilhelm Roehl, som arbetade för färgämnes- och läkemedelskoncernen IG Farben, fortsatte att driva på användningen av färgämnesderivat som läkemedel mot tropiska sjukdomar och tillförde det verktyg som saknades: kanariefågeln, infekterad med fågelmalaria, som rutinmässig testmodell för kandidatföreningar. Werner Schulemann ändrade sedan sidokedjan, och det resulterande fenotiaziniumsaltet botade den experimentella infektionen. Det färgade fortfarande patienterna blå.

Det bestående resultatet visade sig vara varken färgämnet eller ringsystemet, utan sidokedjan. Att lägga till en dialkylaminoalkylaminogrupp förändrade molekylens beteende, och fragmentet överlevde varje senare omkonstruktion. Behåll den gruppen och byt ut fenotiaziniumringen mot en akridinring, så blir resultatet kinakrin. Byt till en kinolinring, så blir resultatet klorokin. Pamakin, primakin och amodiakin, som alla fortfarande ingår bland malarialäkemedlen, har samma grupp. Föreningen som misslyckades som behandling bidrog med den del som lyckades.

Kopplingen till antipsykotika går via ringen snarare än via läkemedlet. Det var klarläggandet av metylenblåtts struktur som ledde Heinrich August Bernthsen till den grundläggande fenotiazinkärnan 1883. Det var denna grundstruktur, substituerad på olika sätt, som kemister vid Rhône-Poulenc arbetade med på 1940-talet när de sökte efter antihistaminer. En av dessa föreningar syntetiserades omkring slutet av 1950 och testades av kirurgen Henri Laborit, som noterade att den gjorde patienterna lugna och likgiltiga. Den första publicerade psykiatriska användningen, hos en patient med mani, kom i januari 1952. Det första antipsykotiska läkemedlet är inte så mycket en efterföljare till Ehrlichs malarialäkemedel som en avlägsen släkting till färgämnet han började med.

Tre vanor värda att ta med sig från denna episod

1. ”Det första syntetiska läkemedlet som användes inom medicinen” beskriver en kategori, och förbehållen är större än formuleringen antyder. Formuleringen har blivit etablerad; en ofta citerad översikt av Schirmer och kollegor i Neurobiology of Aging kallar metylenblått det allra första helt syntetiska läkemedlet som användes inom medicinen. Kloralhydrat introducerades som syntetiskt sedativum 1869, mer än tjugo år tidigare. Artikeln från 1891 ger själv en del av svaret, eftersom författarna nämner de syntetiska febernedsättande medel som redan hade misslyckats mot malaria, däribland kinolin, antipyrin och antifebrin. Ehrlichs eget arsenikpreparat mot syfilis kom ännu senare. Den försvarbara versionen av påståendet handlar om metod snarare än om att vara först: metylenblått hör till de tidigaste syntetiska föreningarna som valdes för att verka mot en specifik organism utifrån en kemisk teori om selektivitet.
2. Selektiv fördelning är inte selektiv nytta. Ehrlichs resultat från 1886 var att färgämnet når nervvävnad. Var en förening hamnar och vad den gör när den kommer fram är två olika mätningar, och den första är mycket lättare att genomföra. I den luckan har de flesta påståenden om metylenblått och hjärnan hållit till sedan dess.
3. Renhet hör till beläggen, inte till marknadsföringen. Det historiska underlaget är tvetydigt av just detta skäl. Små strukturskillnader förändrar var denna förening hamnar, och därför måste ett analyscertifikat vara kopplat till en specifik tillverkningssats i stället för att presenteras som ett allmänt intyg om att en produkt är testad. En säljare som hävdar överensstämmelse med farmakopémonografin men bara testar tungmetaller påstår mer än rapporten stöder. Blupreme köper metylenblått från en läkemedelstillverkare och testar hela den specifikation som monografin anger: identitet, renhet, organiska föroreningar, lösningsmedelsrester, elementföroreningar, glödgningsrest, mikrobiella gränsvärden och bakteriella endotoxiner. Rapporten publiceras tillsammans med produkten, och sidan om metylenblått av USP-kvalitet förklarar dessa gränsvärden och varför resultatet för azure B är det första man bör leta efter.

Ett daterat källspår

Den daterade följden av milstolpar, inklusive färgämneskemin som föregick Ehrlich och de kvalitetsgrader och specifikationer som kom efter honom, redovisas separat i metylenblåtts historia, och föreningens egen identitet behandlas i vad metylenblått är.

Illustrationerna bakom denna redogörelse, återgivna i översikten från 2012 av Krafts, Hempelmann och Skórska-Stania, är inte likvärdiga, och ett exempel visar varför. Planschen från 1891 är primärdokumentationen av försöket; porträttet från 1910 bredvid den daterar ett anseende och inget annat. Sidor ur Andersags anteckningsbok från 1934 är det direkta spåret av kinolinsubstitutionen, skrivet med kemistens egen hand.

Den uppriktiga sammanfattningen av Ehrlichs färgämnesexperiment är att han hade rätt om selektiviteten och rätt om målet, men fel om mekanismen. Metylenblått ansamlas faktiskt i nervvävnad och skadar faktiskt malariaparasiten. Det gör inte det senare på grund av det förra, och den kemiska förklaring han gav till båda var fel. Det han visade bortom tvivel var mer bestående än en korrekt mekanism: en förening kan väljas i stället för att hittas, och väljas utifrån belägg som samlats in innan någon ger den till en patient.