Artikel
Metylenblåtts löslighet och beredning av lösningar: en laboratorieguide
Två tekniker bereder varsin 1-procentig lösning av metylenblått från pulver. Den ena väger upp 1.00 gram och fyller kolven till 100 mL. Den andra väger upp 1.00 gram, tillsätter det till 100 mL vatten och anser sig vara klar. En tredje tekniker väger upp 1.00 gram från en annan sats och får en mätbart annorlunda koncentration. Alla tre flaskorna är märkta på samma sätt. Ingen av dem innehåller riktigt det som står på etiketten, och skillnaderna beror på tre begrepp som är lätta att blanda ihop: hur mycket lösningsmedlet kan lösa, vad det uppvägda pulvret faktiskt är och vad procenthalten avser.
Den här guiden handlar enbart om beredning för laboratoriebruk: färgningslösningar, indikatorer, analytiska stamlösningar och bruksspädningar. Den är inte ett recept för läkemedel som tas via munnen eller injiceras, och koncentrationerna här ska inte tolkas som doser.
Vad lösligheten avgör, och vad den inte avgör
Metylenblåtts löslighet i vatten är hög för ett färgämne. PubChems ämnespost för metylenblått anger cirka 43.6 gram per liter vid 25 C, vilket motsvarar 4.36 gram per 100 mL, eller 4.36 procent w/v. En oberoende jämviktsstudie vid samma temperatur uppmätte 43.21 g/L och bekräftade det äldre värdet inom mätosäkerheten.
Det talet är en övre gräns, inte ett målvärde. En 1-procentig stamlösning är 10 g/L, mindre än en fjärdedel av gränsen. En 0.1-procentig stamlösning är 1 g/L, ungefär en fyrtiondel av den. Om fasta partiklar finns kvar i en 1-procentig beredning efter ordentlig blandning vid rumstemperatur är problemet nästan aldrig löslighetsgränsen. Det handlar vanligtvis om ofullständig vätning, kallt vatten, pulverklumpar som behöver mer tid eller ett felidentifierat löst ämne. Varmt vatten och omrörning löser de flesta av dessa problem. Om uppvärmning har använts ska kolven få återgå till sin kalibreringstemperatur innan lösningen fylls upp till slutvolymen.
Lösligheten i andra lösningsmedel är lägre och varierar mer mellan källor, delvis eftersom det testade materialets hydratform skiljer sig åt. Vatten förblir referenslösningsmedlet för rutinmässiga stamlösningar i laboratoriet. Etanol löser färgämnet men kan lösa betydligt mindre än vatten. Kloroform löser det också, pyridin endast i liten utsträckning och dietyleter i princip inte alls. Aceton och etylacetat ligger långt under vatten i uppmätta serier. Vid arbete med icke-vattenbaserade lösningar bör ett handboksvärde betraktas som en första uppskattning och verifieras med den aktuella satsen, inte användas som en gräns för beredningen. Den praktiska slutsatsen är enkel: om målet är en definierad vattenlösning med en koncentration på högst 1 procent ger vatten god marginal.
Pulvret är inte en enda form
Metylenblåttspulver som säljs för laboratoriebruk är ett kloridsalt som innehåller vatten i sitt kristallgitter, och mängden vatten varierar. Den vattenfria jonen har en molmassa på 319.85 g/mol. Det ofta angivna trihydratet har en molmassa på 373.90 g/mol och pentahydratet på 409.93 g/mol, värden som finns i USP-monografidata sammanfattade i anslutning till PubChem-posten.
Kommersiella flaskor är ofta märkta med trihydrat, CAS 7220-79-3, men studier av det fasta tillståndet har visat att det verkliga materialet kan vara ett pentahydrat, ett partiellt hydrat med cirka 2.2 vattenmolekyler, ett dihydrat eller ett monohydrat, utan någon tydlig kristallin trihydratfas i vissa analyser. Färgämnet är också hygroskopiskt, så vattenhalten i en öppnad flaska förändras. Vid kvalitativ färgning spelar detta knappt någon roll. Vid kvantitativt analytiskt arbete har det stor betydelse, och därför betraktar vägledningen om hur halt och vatteninnehåll i ett analyscertifikat ska läsas satsdokumentet som mer tillförlitligt än ordet trihydrat på framsidans etikett.
Detta ger två möjliga korrigeringsmetoder, och endast en ska användas åt gången. Om certifikatet anger halt och vatteninnehåll eller torkförlust ska dessa värden användas direkt. Om certifikatdata saknas och koncentrationen måste uttryckas som vattenfri ekvivalent används den teoretiska hydratfaktorn: 373.90 dividerat med 319.85, eller 1.169, för nominellt trihydrat, och 409.93 dividerat med 319.85, eller 1.282, för nominellt pentahydrat. Använd inte båda korrigeringarna samtidigt. Då räknas vattnet dubbelt.
Vad procent betyder
Procent w/v betyder gram av det specificerade lösta ämnet per 100 mL färdig lösning, inte per 100 mL vatten från början. Alltså är 1 procent w/v 1.000 g per 100 mL slutvolym, vilket motsvarar 10 mg/mL eller 10 g/L. En 0.1-procentig lösning är 0.100 g per 100 mL slutvolym, vilket motsvarar 1 mg/mL. Den vanliga sammanblandningen av 1 procent och 1 mg/mL ger ett fel med en faktor tio, och det är värt att kontrollera varje etikett för detta.
Definitionens andra del är specifikationen av det lösta ämnet. En 1-procentig lösning av trihydratpulver räknat som uppvägt och en 1-procentig lösning uttryckt som vattenfri ekvivalent är olika lösningar. Beräkningsexemplen nedan anger både slutvolym och beräkningsgrund varje gång. Den vanan förhindrar problemet med de tre teknikerna ovan.
Beräkningsexempel för beredning, med angivna hydratantaganden
Alla exempel förutsätter rent pulver av det angivna hydratet och vatten som lösningsmedel vid rumstemperatur. Skala linjärt för andra volymer.
Exempel A: 100.0 mL med 1 procent w/v, beräknat på uppvägt trihydrat. Väg upp 1.000 g metylenblåtttrihydrat. Tillsätt cirka 70 mL renat vatten, rör om eller rotera kärlet tills allt är upplöst, överför kvantitativt till en 100.0 mL mätkolv med sköljningar och tillsätt sedan vatten till märket. Det lösta ämnet är själva trihydratet, så ingen molmassakorrigering ska göras. Resultat: 1.000 g per 100.0 mL slutvolym, eller 10 mg/mL räknat som uppvägt pulver.
Exempel B: 100.0 mL med 1 mg/mL, beräknat som vattenfri ekvivalent, från nominellt trihydrat. Målet är 100.0 mg vattenfritt metylenblått i 100.0 mL slutvolym. Multiplicera med 1.169 för att korrigera för de tre vattenmolekylerna: 100.0 mg gånger 1.169 är lika med 116.9 mg. Väg upp 116.9 mg nominellt trihydrat, lös det i cirka 70 mL vatten och fyll upp till 100.0 mL slutvolym i en mätkolv. För nominellt pentahydrat är faktorn 1.282, så samma mål kräver 128.2 mg. Anteckna på etiketten vilken faktor som användes.
Exempel C: spädning av metylenblått från en 1-procentig stamlösning till 0.1 procent. Använd C1V1 lika med C2V2. För att bereda 100.0 mL med 0.1 procent från en 1.0-procentig stamlösning behövs en stamlösningsvolym på 0.1 gånger 100.0 dividerat med 1.0, vilket är 10.0 mL. Pipettera 10.0 mL av den 1-procentiga stamlösningen till en 100.0 mL kolv och tillsätt vatten till märket. För analytiker som föredrar massenheter: 1 procent är 10 mg/mL, så 10.0 mL innehåller 100 mg, och 100 mg i 100.0 mL slutvolym är 1 mg/mL, vilket är 0.1 procent.
Exempel D: 1.000 L brukslösning med 10 mg/L från en stamlösning med 1 mg/mL. En stamlösning med 1 mg/mL är 1000 mg/L. Den volym som behövs är 10 gånger 1.000 dividerat med 1000, vilket är 0.0100 L, eller 10.0 mL. Pipettera 10.0 mL stamlösning och späd med vatten till 1.000 L slutvolym. Från en 1-procentig stamlösning med 10,000 mg/L kräver samma mål endast 1.00 mL som fylls upp till 1.000 L. Seriespädning i två steg ger bättre noggrannhet än en enda överföring i mikroliterskala när spädningsförhållandet överstiger ungefär ett till hundra.
Vart och ett av dessa exempel är en fullständig specifikation endast för att det innehåller tre uppgifter: den uppvägda massan med sitt hydratantagande, lösningens slutvolym och grunden för den angivna koncentrationen. En anteckning i laboratoriejournalen som saknar någon av dessa tre uppgifter kan inte reproduceras exakt.
En arbetsgång som undviker de vanliga felen
Lös först pulvret i mindre än slutvolymen och fyll sedan upp till rätt volym. Om pulver tillsätts direkt till hela den avsedda slutvolymen vatten blir lösningens totala volym större än den avsedda volymen, och koncentrationen blir för låg. Skölj över bägarens innehåll till kolven så att inget färgämne blir kvar. Den intensiva färgen gör små förluster synliga, vilket är en fördel om det leder till kvantitativ överföring.
Blanda tills inga partiklar återstår innan du fyller upp till slutvolymen, och inspektera mot ljuset. Filtrera endast när metoden kräver det. Metylenblått adsorberas till vissa membranmaterial, så filtrering kan sänka koncentrationen i en stamlösning vars koncentration just har fastställts. Detta finns dokumenterat i studier av membranadsorption och är värt att komma ihåg när filtrering eller koncentrationskontroll ingår i metoden. Om en filtrerad stamlösning måste ha en certifierad koncentration ska koncentrationen verifieras efter filtreringen, inte före.
Förvara beredda lösningar skyddade från starkt ljus i bärnstensfärgade eller ogenomskinliga flaskor vid rumstemperatur, och märk dem med löst ämne, hydratgrund, koncentration, lösningsmedel, datum och vem som berett lösningen. Fotoblekning vid långvarig belysning är en känd nedbrytningsväg, så fönsterbrädor och upplysta kylskåp är olämpliga förvaringsplatser även om färgämnet ser stabilt ut. Förväntad stabilitet och intervall för omkontroll hör hemma i vägledningen om förvaring och stabilitet för beredda lösningar, men som arbetsregel bör analytiska stamlösningar beredas på nytt eller verifieras igen snarare än betraktas som tillförlitliga på obestämd tid.
Hantera pulvret och koncentrerade stamlösningar med handskar, ögonskydd, laboratorierock och skydd på arbetsbänken, och använd sekundärt uppsamlingsskydd för flaskor. Färgämnet färgar snabbt hud, kläder, arbetsbänkar och plast, och leverantörernas säkerhetsdatablad klassificerar pulvret som skadligt vid förtäring och irriterande för ögon och hud beroende på kvalitet. Fullständiga försiktighetsåtgärder hör hemma i rutinerna för säker hantering och förvaring, men kontroll av färgämnesspill är i sig en kvalitetsåtgärd: oavsiktliga färgämnesrester på glasutrustning och pipetter är en källa till korskontaminering vid spåranalys.
En kommentar om kvalitet
För färgningsbad och demonstrationer fungerar alla rena laboratoriekvaliteter som bereds till rätt koncentration. För kvantitativt eller jämförande arbete spelar kvaliteten roll eftersom föroreningarna skiljer sig åt: rester av Azure B och besläktade tiaziner, tungmetaller, restlösningsmedel och mikrobiell belastning. Därför är valet av en kvalitet som stöds av ett fullständigt analyscertifikat en del av beredningen, inte något man tänker på i efterhand. Ett fullständigt satsdokument anger identitet, halt med angiven beräkningsgrund, vatteninnehåll och vilka föroreningar som faktiskt har testats, så att hydratkorrigeringen i exemplen ovan använder uppmätta värden i stället för antagandet om nominellt trihydrat. När två satser ger olika koncentrationer från samma uppvägda massa förklarar certifikatet vanligtvis varför.