Metylenblått och multipel skleros: vad djurforskningen undersökte

Söker du efter metylenblått vid MS hittar du artiklar som ser ut att besvara samma fråga. Det gör de inte. I den ena studien gavs metylenblått till sjuka möss som behandling. I den andra behandlades inget djur med det. Där användes metylenblått som ett blått färgämne på tunna ryggmärgssnitt så att en patolog kunde se myelin i mikroskop.

Det här är grundtanken bakom hela artikeln. Färgämnet har två roller inom biologin, och de har inget gemensamt utöver flaskan. Som läkemedelskandidat ges det till ett levande djur, och frågan är om sjukdomen förändras. Som färgämne appliceras det på död, fixerad vävnad efter experimentet, och frågan är hur vävnaden såg ut. Missar du den skillnaden kommer du att läsa ett metodavsnitt om patologi som om det vore ett behandlingsresultat.

Vad EAE är, enkelt förklarat

Experimentell autoimmun encefalomyelit, vanligen förkortat EAE, är den djurmodell som oftast används för att efterlikna vissa aspekter av multipel skleros. En forskare immuniserar en mottaglig mus med ett fragment av ett myelinprotein tillsammans med ett starkt adjuvans. Immunförsvaret angriper sedan djurets eget centrala nervsystem. Musen utvecklar en uppåtstigande svaghet som enkelt kan poängsättas på en skala från 0 till 5, från slapp svans till förlamning av bakbenen.

Den enkla poängsättningen förklarar varför EAE är populärt, men också varför modellen kan vara missvisande. MS hos människor uppstår spontant, omfattar en bredare och mindre tydligt definierad uppsättning målmolekyler och ger synrelaterade, sensoriska, kognitiva, cerebellära och motoriska symtom i skovvisa eller progressiva förlopp. EAE återskapar utvalda mekanismer, såsom inflammation, demyelinisering och axonskada, under kontrollerade förhållanden. Modellen återskapar inte MS i miniatyr. Läsare som vill ha den övergripande bilden kan gå igenom hur metylenblått antas verka på cellnivå innan de bedömer ett enskilt påstående om en sjukdom.

De två studierna nedan använde också olika EAE-antigener, vilket spelar roll. Behandlingsstudien framkallade sjukdom med MOG35-55, en kort peptid från myelinoligodendrocytglykoprotein. Patologistudien framkallade sjukdom med MP4, en fusion av segment från myelinets basiska protein och proteolipidprotein. Valet av musstam och antigen påverkar var lesioner uppträder och hur inflammationen beter sig, så de två studierna är inte två upprepningar av samma experiment.

Översikten: från modell till fråga till begränsningar

Ha den här tabellen till hands. Den är artikelns grundläggande referens. Varje rad anger vilken klinisk fråga modellen kan belysa, vad som faktiskt mättes och var överförbarheten tar slut.

Den som granskar nästa rubrik kan återanvända samma kolumner med hjälp av hur man läser prekliniska studier: fråga vilken art och vilket antigen som användes, vilken roll ämnet hade, vilka utfallsmåtten var och om resultatet beskriver ett sjukdomsförlopp eller en ögonblicksbild av vävnaden.

Behandlingsresultatet: vad tillförseln förändrade

Behandlingsstudien från 2016 i Journal of Neuroimmunology använde honmöss av stammen C57BL/6, omkring 8 till 10 veckor gamla, som immuniserades med 250 mikrogram MOG35-55 per mus. Efter induktionen randomiserades EAE-djuren till en grupp som fick metylenblått eller en obehandlad EAE-grupp, och kliniska poäng följdes till ungefär dag 30.

De kliniska poängen var signifikant lägre hos behandlade möss än hos EAE-kontroller från dag 15 till dag 30, med P mindre än 0.01. Ryggmärgsanalysen pekade åt samma håll, med mindre inflammatorisk infiltration, mindre demyelinisering och mindre axonförlust hos behandlade djur.

Det utmärkande var analysen av signaleringen. Behandlingen ökade AMPK-aktiveringen och SIRT1-uttrycket och hämmade aktiveringen av NF-kB, en central regulator av inflammation. Inom det adaptiva immunförsvaret minskade den Th17-svaret och förstärkte Treg-svaret. Den föreslagna kedjan går därför från metylenblått till AMPK och SIRT1, vidare till lägre NF-kB-signalering, en förskjutning från inflammatoriska Th17 till regulatoriska Treg, lindrigare vävnadsskada och lägre poäng.

Den kedjan är en tolkning, inte ett bevisat orsakssamband. Studien visar att läkemedlet, signalförändringarna och sjukdomsförbättringen följs åt. Den bevisar inte att AMPK och SIRT1 förmedlar hela nyttan, och den offentligt indexerade texten redovisar inte den exakta dosen i milligram per kilogram, administreringsvägen, startdagen eller behandlingstiden tillräckligt tydligt för att behandlingsupplägget ska kunna återskapas enbart från sammanfattningen. Betrakta varje dosuppgift som anges om den här artikeln på en försäljningssida som obekräftad, om den inte hänvisar till metodavsnittet i fulltexten. Det bredare evidensunderlaget för metylenblått hos människor är rätt ställe att kontrollera om denna tidiga immunologiska signal någonsin ledde vidare till kliniska data.

Patologiresultatet: vad sex månaders vävnadsanalys visade

MP4-studien från 2015 i PLoS ONE använde honmöss av stammen C57BL/6 som immuniserades med 200 mikrogram MP4 i komplett Freunds adjuvans samt pertussistoxin på immuniseringsdagen och återigen 48 timmar senare. Inget djur fick metylenblått som läkemedel. Efter fixering och inbäddning färgades tvärsnitt av ryggmärgen med en tjocklek på en mikrometer med metylenblått för ljusmikroskopi. Elektronmikroskopi av den ventrolaterala banan användes för finare detaljer.

Vävnadsprover togs i tre stadier: vid den akuta toppen med 7 möss, tre månader efter debut med 5 möss och sex månader efter debut med 10 möss. De genomsnittliga kliniska poängen vid dessa stadier såg nästan identiska ut, omkring 1.7 till 1.8 på skalan från 0 till 5. Vävnaden berättade en annan historia. Isolerad myelinskada ökade från omkring 569,000 fibrer per kvadratmillimeter vid den akuta toppen till omkring 1,496,000 efter sex månader, och jämförelsen mellan det akuta skedet och långtidsuppföljningen var signifikant med P lika med 0.027. Kombinerad myelin- och axonskada ungefär fördubblades efter sex månader. Andelen remyeliniserande fibrer låg under en procent i varje stadium, vilket är en tankeväckande detalj för förhoppningarna om reparation.

Axonskadan följde ett U-format mönster: hög vid den akuta toppen, lägre efter tre månader och högst efter sex månader. Den korrelerade med mitokondriell svullnad och med minskat avstånd mellan neurofilament. Bedömningen gjordes utan kännedom om poäng eller stadium, vilket stärker tolkningen att de kliniska poängen underskattade den pågående strukturella skadan.

Denna skillnad är studiens verkliga bidrag för den som läser om MS. En stabil funktionsnedsättningspoäng betydde inte stabil vävnad. Den visar också varför den här artikeln inte kan stödja något påstående om metylenblått som behandling vid MS. Studien undersökte tid, inte behandling.

Varför ingen av studierna fastställer nytta för patienter

Se varje artikel som ett bra svar på en snäv fråga, men inte alls som ett svar på frågan om patienter.

För det första skiljer sig orsaken. EAE utlöses avsiktligt med ett definierat antigen och adjuvans. MS hos människor utvecklas spontant med en bredare immunologisk repertoar som omfattar T-celler, B-celler, medfödd immunitet och vävnadsresidenta gliaceller. Ett ämne som förändrar ett MOG-präglat svar hos en mus behöver inte förändra det bredare svaret hos människor.

För det andra skiljer sig fenotypen. Uppåtstigande svaghet från svansen till bakbenen hos en mus är ett praktiskt mätvärde. Det komprimerar heterogeniteten hos mänsklig MS till ett enda motoriskt tal. Läkemedel förändrar ofta EAE-poäng på kort sikt utan att förändra sjukdomsförlopp hos människor. Därför är EAE ett verktyg för screening och mekanismstudier snarare än en klinik i miniatyr.

För det tredje är exponering och tidpunkt fortfarande oklara. Kontinuerlig tidig tillförsel i ett musförsök på 30 dagar är inte detsamma som långvarig oral användning hos en person med etablerad sjukdom, och ingen av studierna mätte läkemedelsnivåer i nervsystemet. Utan den kopplingen finns ingen brygga från en koncentration på en platta eller en dos hos en mus till ett behandlingsupplägg för människor.

För det fjärde replikerar de två artiklarna inte varandra. Olika antigener, olika frågor, olika utfallsmått och i det ena fallet ingen behandling alls. Att citera dem tillsammans som två positiva studier av MS-behandling är ett kategorifel.

Vad detta betyder för läsare som väger evidensen

Det finns inget etablerat behandlingsprotokoll med metylenblått för MS i dessa artiklar. Behandlingsstudien ger stöd för fortsatt forskning om AMPK, SIRT1, NF-kB och balansen mellan Th17 och Treg vid MOG-EAE. Patologistudien påminner om att vävnadsskada kan fortskrida samtidigt som poängen ser oförändrade ut, och att metylenblått i ett metodavsnitt ibland betyder en färgningsburk snarare än ett medicinskåp. Läsare som följer pågående forskning om multipel skleros bör hålla skillnaden mellan färgämne och läkemedel i minnet. Säkerhetsfrågor, inklusive blodrelaterade risker och interaktionsrisker, hör hemma i ett samtal med läkare tillsammans med allmänna säkerhetsdata om metylenblått innan någon agerar utifrån rubriker om laboratoriefynd.

Slutsatsen ryms i en mening. Den ena citerade studien gav metylenblått till möss med MOG-EAE och rapporterade lindrigare sjukdom med en antiinflammatorisk förändring i immunsvaret, medan den andra citerade studien inte gav någon behandling och använde metylenblått enbart för att färga ryggmärgen samtidigt som den dokumenterade sex månaders ansamling av myelin- och axonskador, så de två studierna fastställer inte att metylenblått hjälper vid MS hos människor.